猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立

为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法建立及初步应用研究

为建立一种特异、敏感的PEDV的检测方法。根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒CV777株的M基因序列,设计了一对特异性引物,扩增长度为680 bp的片段。将PCR产物进行测序,与CV777株、SH5株M基因的同源性分别为99.2%和97.6%。试验表明：该方法具有较好的特异性和敏感性,并能检测到PEDV的RNA浓度下限为100 pg/μL。从福建省的3个地区共采集58份哺乳仔猪腹泻样品,并应用此方法进行检测,其阳性检出率为87.9%。     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立

摘要：参照国内外已发表的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因序列及其相关的RT-PCR检测方法,根据TGEV S蛋白基因和PEDV S基因各设计一套特异性通用引物,扩增目的带分别为426bp和584bp。通过对相关病毒检测,建立了TGEV和PEDV通用型二联RT-PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可为TGEV和PEDV的检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒N重组表达蛋白间接ELISA检测方法建立

为了检测猪血清中猪流行性腹泻病毒抗体水平,用纯化的猪流行性腹泻病毒N基因重组表达蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA方法。ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为0.5μg/m L,包被时间4℃过夜,5%脱脂乳的PBS封闭37℃2 h及4℃过夜。血清稀释度为1∶100;37℃作用45 min,辣根过氧化物酶标记兔抗猪Ig G稀释度为1∶10 000,37℃温育60 min,底物显色37℃15 min。抗体临界值为OD450nm≥0.30判为阳性,OD450nm≤0.27判为阴性,介于二者之间判为可疑。经重复性试验和交叉试验,结果表明,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本184份,总阳性率为68.5%。     

弧菌融合蛋白TDH-VVC-VMHA的表达及弧菌毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为提高食品中副溶血弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌毒素初筛的速度与效率,建立了双抗体夹心ELISA检测方法。以融合蛋白TDH-VVC-VMHA包涵体为抗原免疫豚鼠,采用豚鼠抗融合蛋白免疫血清为包被抗体,辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗豚鼠IgG为标记抗体,应用棋盘滴定法确定ELISA的最适条件。结果表明,所建立的方法与副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌的培养物上清有较明显的阳性反应,与绿脓杆菌、金黄色葡菌球菌、李氏杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等5种非弧菌属食物中毒菌培养物上清未见交叉反应,与溶藻弧菌、河流弧菌和麦氏弧菌等3种弧菌培养物上清也未见交叉反应。这说明,该方法可以用于食品中副溶血弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌毒素的快速同步免疫学检测。     

虎源流感病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用研究

为临床上能快速诊断虎流感,通过对已分离获得的虎源H5N1流感病毒和GenBank中报道的A型H5N1亚型流感病毒的NP、HA、NA序列,设计合成各个基因的特异性PCR扩增引物和A型流感病毒通用反转录引物。通过优化反应体系及条件,建立一步法可同时扩增出3个基因的联合RT-PCR检测方法。将该方法用于临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法进行比较。结果,NP、HA、NA基因的扩增片段大小分别为464bp、581bp、173bp,其检测的敏感性约100个TCID50。该方法的检出率和病毒分离结果相符,高于电镜负染和HA/HI试验。结果显示,该方法可用于虎源流感病毒的临床或实验室检测。     

耕地质量提升技术及其应用

合理引导农户采用具有提升耕地质量的技术对于提高土壤肥力、改善土壤健康,促进作物高产高效和耕地健康可持续至关重要。本研究分析了耕地质量提升的影响因素,综述了包括秸秆还田技术、绿肥种植技术、深耕深松技术、有机肥施用技术、测土配方施肥技术、水稻机械化侧深施肥技术、施用土壤调理剂技术和水肥一体化技术等耕地质量提升技术,对这些技术的优缺点进行归纳,总结应用措施。目前研究关注点主要集中在耕地质量提升技术的集成应用、农户各项技术采纳的差异性以及现代信息技术平台和设备产业化应用。最后提出应完善耕地多功能的技术标准和方法制定、强化高分遥感等信息技术对耕地质量进行监测与评价、提高耕地资源利用效率和健全农户生态补偿机制等方面的研究工作。     

影响红薯贮藏保鲜的因素及其保鲜技术

分析了影响红薯贮藏保鲜的主要因素,概述了红薯的主要贮藏技术。     

棉花胚性细胞悬浮系的建立及其影响因素分析

对棉花悬浮细胞系建立过程中激素的配比和浓度、培养基成分、悬浮细胞的生长过程及衰老过程中PCD的发生系统研究结果表明:MS 2,4 D0.5mg·L 1 KT0.1mg·L 1和MS 2,4 D0.1mg·L 1 KT0.1mg·L 1培养基有利于细胞分裂,能产生体积较大,均匀一致,细胞活力强的单细胞和小细胞团,适合于进行细胞生长调控等研究。而MS IBA0.5mg·L 1 KT0.1mg·L 1和MS IBA0.1mg·L 1 KT0.1mg·L 1培养基则有利于形成大的细胞团和不同时期的胚状体,适合于进行胚状体的发育研究。钾盐、肌醇有利于细胞的分裂增殖,且能抑制胚状体的发生。可通过增加钾盐(K )、肌醇含量来调节细胞的生长状态和细胞活性,以建成分裂增殖快、细胞活性强的悬浮细胞系。在悬浮培养过程中,管状细胞渐渐消失,被球状的单细胞和小细胞团所替代。棉花胚性愈伤悬浮细胞的生长曲线呈S形,在起始培养的0～3d是生长的延迟期;在第3～15天是指数增长期;到第15天以后,生长速度降低,是静止期。悬浮培养的棉花细胞必须在15d以前进行继代,以保持其旺盛的分裂能力和细胞活性。     

应用B.melitensis 16M单克隆抗体建立羊布病的胶体金免疫层析检测体系

目的 用B.melitensis 16M提纯的LPS和O链抗原作为检测抗原，研制出针对B.melitensis 16M的单克隆抗体（McAb），将其标记胶体金，建立一种诊断布病的胶体金免疫层析方法。方法 B.melitensis 16M全菌免疫Balb/C小鼠，采用杂交瘤细胞技术制备McAb，测定免疫球蛋白亚类及亲和力。用HiTrap Protein G HP亲和层析纯化抗体并用胶体金标记，建立胶体金免疫层析方法。选择最佳反应模式组装成试纸条，对其特异性、敏感性、稳定性、阳性病料试验。结果 筛选出能稳定分泌抗B.melitensis 16M的种特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株2D10、3C6、1E10，单抗亚类分别为IgG2a、IgG1，亲和常数（k）介于1×10-8~2.6×10-10。根据配对实验，以3C6为最佳包被抗体，2D10为最佳金标抗体。抗体IgG标记浓度为30μg/ml时，检测效果最佳。同时，与B.melitensis 16M多抗IgG作为包被抗体、2D10为金标抗体的检测体系对比，两种包被方法组装的试纸条最低检出量为5.0×103CFU/ml，且不与其它菌发生交叉反应，保持期≥100d。以荧光定量PCR为参照，试纸条检测80份阳性病料，检检出率为100%。结论 建立的胶体金免疫层析方法检测B.melitensis 16M快速、简便、可靠，有望开发成为布病快速诊断试剂盒。     

棉花黄萎病菌毒素ELISA检测方法的建立及其应用

以纯化的棉花黄萎病菌毒素(PLPC)免疫新西兰白兔制备了PLPC特异性抗血清,建立了可特异性检测棉花黄萎病菌毒素的A蛋白双抗体夹心ELISA方法。应用建立的ELISA方法测定了病菌培养滤液、人工接种幼苗和大田病株不同组织中的毒素,结果表明:不同产毒能力菌株(VD 8和VD-5)在25℃下振荡培养3d后就能在培养滤液中检测到毒素,这比生物测定要早2～3d。将VD-8菌株的孢子以灌根方式接种泗棉3号幼苗5d后,就能从接种幼苗的茎杆和叶柄中检测到毒素,这比幼苗自然发病显症要早3～5d。在测定的30份大田病株茎杆、叶柄、叶脉样品中,阳性样品率为100%。这些结果表明建立的ELISA方法可用于菌株产毒能力的测定和大田棉花黄萎病的早期诊断。     

羊环形泰勒虫单管套式PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立羊环形泰勒虫单管套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。根据GenBank上发表的环形泰勒虫Tams1基因序列,设计内、外2对特异性引物,进行单管套式PCR检测方法研究,并进行了特异性、敏感性试验及临床应用试验。结果表明：该检测方法能够扩增的基因片段大小为476 bp,与GenBank收录的相关序列同源性高达93%~98%,而与附红细胞体、新孢子虫、艾美耳球、弓形虫RH株相关病原基因组均无交叉反应,能够检测出DNA的最小量为12 fg。并对57份临床样品进行了检测,检测阳性率为40.4%,高于常规PCR和血涂片镜检测,表明该检测方法具有较高的敏感性,可用于羊环形泰勒虫感染的早期诊断,有较好的临床应用价值。     

异戊烯基腺苷组细胞分裂素的快速酶联免疫吸附测定法的建立

从样品制备，ＥＬＩＳＡ类型及免疫反应时间三方面着手建立了异戊烯基腺苷（ｉＰＡ）组细胞分裂素的快速酶联免疫吸附测定法。用ＮａＩＯ４氧化合成免疫原ｉＰＡ－Ｎ９－ＢＳＡ（ＢＳＡ：牛血清白蛋白）。由此获得的免抗血清效价达１：３４５００。交叉反应试验表明该抗血清只识别ｉＰＡ组细胞分裂素。因此本研究中采用直接型（即固相抗体型）ＥＬＩＳＡ，并将最佳免疫反应平衡时间缩短至３０ｍｉｎ（４℃）。所建立的ｉＰＡ组ＥＬＩＳＡ检测极限为４．７ｆｍｏｌｉＰＡ／孔，线性检测范围０．０１～５０ｐｍｏｌｉＰＡ／孔，板内、板间的变异系数分别为３．７％和５．３％。样品的稀释曲线与标准曲线平行，回收率为８７．１％，表明本研究中采用的８０％甲醇提取、Ｓｅｐ－ｐａｋＣ１８柱初纯化的快速制样程序适合于该ＥＬＩＳＡ。对大豆植株不同部位ｉＰＡｓ含量测定结果表明，根瘤与根尖内ｉＰＡｓ含量显著高于幼叶与顶芽内的ｉＰＡｓ含量。     

鸡传染性支气管炎病毒Real-time RT-PCR检测方法的建立及应用

为定量检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)载量,建立IBV的Real-time RT-PCR方法.用RT-PCR方法扩增出IBV的N基因片段,并克隆到pEASY-T3载体中,构建成含有N基因片段的重组质粒.应用该重组质粒进行SYBR Green I Real-time PCR,建立了定量检测IBV核酸的标准曲线与直线回归方程,该方法显示:特异性强,检测下限至少达到5.58× 102拷贝/μL,其重复性试验的变异系数小于3.2％;用建立的方法对实验接种IBV M41株的雏鸡组织中的病毒核酸进行了定量检测,检测结果显示:攻毒后肾脏中IBV含量高于支气管和肺脏,支气管和肺脏中病毒含量在攻毒后第3天高于攻毒后第7、10天,并证实临床表现与病毒载量之间存在密切关系.研究结果表明,建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于IBV的定量检测.     

ELISA在检测动物组织氯霉素残留中的应用

采用酶联免疫吸附实验 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay ELISA)方法,筛查和定量检测氯霉素（Chloramphenicol）。试样经过乙酸乙酯的萃取和正己烷的净化,在温育过程中,将特异性抗体（兔抗CAP）、酶标记CAP（酶结合物）和CAP标准品或样品,加入预先包被了绵羊抗兔IgG抗体的孔内。特异性的抗体便被固定抗体所结合。与此同时,游离的CAP（存在于标准品或样品）和酶结合CAP便互相竟争CAP抗体结合部位（竞争性酶免检测）。然后温育1h洗涤除去非结合（酶标记）试剂。加入底物,结合的酶结合物可将无色的底物转化为有色产物。加入硫酸,终止底物反应。用装有450nm滤光片的酶标仪进行检测,吸光度值与样品中的CAP浓度成反比。试验结果表明,该方法在0.025~2ng/ml范围内相关系数（R2）大于0.995,检测下限0.02 μg/kg,回收率为78.2%。     

酶联免疫吸附法快速检测谷物中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇

应用ELISA法快速检测麦类、谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),最低检出限为10μg/L,检测范围为10-1 000μg/L。用10%甲醇水溶液提取含DON的小麦及玉米样品,回收率为86～93%,变异系数为4.1%～17.4%。     

马铃薯S病毒RT-qPCR通用检测体系的建立与应用

为实现准确和快速鉴定PVS及其株系,明确PVS在马铃薯叶片、叶柄、茎、根和休眠块茎中含量以筛选适合的检测部位,设计PVS通用简并引物,建立实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术体系,分析熔解曲线鉴定PVS^O和PVS^A株系。以马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯M病毒(PVM)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯卷叶病毒(PLRV)阳性样品为对照检测其特异性。应用PVS^O和PVS^A重组质粒分别建立标准曲线,检测接种PVS^O和PVS^A马铃薯品种尤金和冀张薯12号的5个部位PVS含量。另外,应用该体系检测来源于11个省(市、自治区)的90个PVS阳性样品验证其实用性。PVS^O和PVS^A扩增后熔解曲线分别在85.77～86.00℃和87.78～87.91℃出现特异峰,PVS阴性样品及PVX、PVY、PVM、PVA和PLRV阳性样品的熔解曲线均无上述特异峰。PVS^O和PVS^A...     

东北特早熟棉区不同群体棉花氮临界浓度稀释模型的建立初探

 选用辽棉19号（生育期125 d）和新棉33B（生育期135 d）为材料,于2009年在东北特早熟棉区（辽宁辽阳,41°26'N,123°14'E）设置棉花种植密度（7.50万,9.75万,12.00万株·hm^-2）和施氮量（0,120,240,360,480 kg·hm^-2）试验,研究不同种植密度下棉花氮临界浓度的变化并建立东北特早熟棉区不同群体棉花氮临界浓度稀释模型。结果表明：不同种植密度下棉花氮临界浓度与地上部最大生物量间均符合幂函数关系（N=aW^-b）,模型参数 a ,b 值在不同种植密度下存在差异。同一品种生产相同生物量的需氮量随种植密度的增加而增大,而同一密度下生产相同的生物量新棉33B的氮素吸收量高于辽棉19号。基于氮临界浓度稀释条件下的异速生长参数,氮素营养指数以及动态氮素临界累积量等指标得到的东北特早熟棉区不同群体适宜施氮量的结果一致,表明9.75万株·hm^-2密度下240 kg·hm^-2施氮量为东北特早熟棉区最佳种植密度和施氮量。     

棉花黄萎病菌毒素结合位点初探

以纯化的棉花黄萎病菌毒素(PLPC)免疫新西兰白兔制备了PLPC特异性抗血清。将PLPC(15μg·ml 1)用不同浓度的抗体(1～20μg·ml 1IgG)吸附后处理泗棉3号的切根苗,毒素所引起的症状都有不同程度的减轻。表明所制备的抗体在与毒素发生特异性免疫学反应的同时,可部分封闭毒素分子上与毒素受体结合的位点。利用竞争ELISA测定了泗棉3号幼苗子叶的质膜制剂与PLPC的结合活性。结果表明,质膜制剂与毒素结合后能部分阻断毒素与其抗体的免疫学反应,即质膜制剂中含有毒素的结合位点。分别用胰蛋白酶和煮沸处理质膜制剂后,质膜制剂对毒素与其抗体的反应的抑制作用消失,初步表明质膜制剂中与毒素结合的是蛋白质。