番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性

2001年从辽宁省不同地区的保护地中采集番茄灰霉病果或病叶，经单孢分离共获得番茄灰霉病菌70株。采用菌丝生长速率法测定了其对嘧霉胺的敏感性。结果表明，番茄灰霉病菌已对嘧霉胺产生中等水平抗药性，抗性频率为20．0％。经室内药剂诱导获得了高抗菌株，抗性倍数最高达35．7倍。嘧霉胺与多菌灵及嘧霉胺与速克灵间不存在交互抗药性。野生抗性菌株具有较好的遗传稳定性，连续转接9次后抗药性无明显下降。不同菌株的菌丝生长速度、鲜重和渗透敏感性存在显著差异，但该差异与灰霉病菌对嘧霉胺的敏感性无相关性。抗性菌株与敏感菌株具有同样的致病能力。     

浙江省果蔬灰葡萄孢对啶酰菌胺的抗性

以2004—2006年从浙江、江苏等地采集的灰葡萄孢对啶酰菌胺的敏感性基线[EC₅₀ = (1.07 ± 0.11) mg/L]为依据,采用菌丝生长速率法连续监测了浙江省果蔬灰葡萄孢群体对啶酰菌胺的敏感性变化。结果表明:浙江省果蔬灰葡萄孢对啶酰菌胺的抗性发展迅速,2012—2013年和2017—2018年的平均EC₅₀值分别为 (5.23 ± 7.79) 和 (24.30 ± 49.33) mg/L。其中,2012—2013年的抗药性菌株频率为15.3%,且均为低水平抗性 (LR) 菌株;而2017—2018年的抗药性频率上升至53.2%,并出现了7.5%的中等水平抗性 (MR) 菌株和1.3%的高水平抗性 (HR) 菌株。啶酰菌胺抗性菌株的菌丝生长速率、产孢量、产菌核数和致病力与敏感菌株相比均无显著差异。抗药性分子机制研究表明:啶酰菌胺抗性菌株的琥珀酸脱氢酶B亚基 (SDH B) 均发生了点突变,共包括H272R、P225F和N230I 3种类型,其中H272R型突变占88.5%;其SDH A和SDH D均未发生点突变;而SDH C的突变 (G85A + I93V + M158V + V168I) 与对药剂敏感性之间无明显联系。     

ABC转运蛋白BcAtm1参与灰葡萄孢分生孢子萌发及对寄主植物的侵染

 灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)引起的灰霉病可在200多种植物上发生,每年造成全世界高达近千亿美元的损失。Atm1是一种在真核生物中进化保守的线粒体内膜ABC转运蛋白,主要通过向细胞质转运Fe/S簇参与维持细胞的正常生命活动,但Atm1在病原菌致病过程中的作用至今仍不清楚。本研究筛选到一株灰葡萄孢ATM1被T-DNA标记的致病缺陷突变体,并在野生型中对该基因实施了敲除。表型分析发现,突变体ΔBcatm1的分生孢子萌发缓慢且不同步,培养4 h的萌发率只有10%(野生型超过90%),直到12 h,萌发率才接近90%;突变体菌丝生长速度减慢,只能达到野生型水平的67%;菜豆成熟叶片离体接种实验显示,突变体ΔBcatm1基本丧失了致病能力,侵入寄主后只能在接种点附近引发微小的病斑,病斑面积只能达到野生型的10%左右。将完整的BcATM1基因重新导入突变体ΔBcatm1可以完全或部分恢复上述异常表型。本研究结果表明BcATM1是一个关键的致病相关基因,参与了灰葡萄孢分生孢子的萌发、菌丝生长及侵染寄主等过程。     

香豆素对灰葡萄孢霉菌抑菌作用机理初探

为探究香豆素对灰葡萄孢霉菌Botrytis cinerea作用机理的影响,通过抑菌试验、酶活试验及电导率试验,分析香豆素对灰葡萄孢霉菌的抑菌活性,以及经香豆素处理后灰葡萄孢霉菌胞内外蛋白质含量、酶活性以及细胞膜透性的变化规律,揭示香豆素对灰葡萄孢霉菌的抑菌机理。结果表明:在PD液体培养基上香豆素对灰葡萄孢霉菌的EC₅₀值为101 mg/L;处理组胞内及胞外蛋白浓度均低于对照组蛋白浓度;香豆素浓度为101 mg/L时对灰葡萄孢霉菌三磷酸腺苷酶 (ATPase) 和过氧化氢酶 (CAT) 的抑制率分别为62.60%和76.5%,对纤维素酶 (CL)、多聚半乳糖醛酸酶 (PG) 和果胶酶 (pectinase) 的抑制率分别为57.63%、64.51%和61.13%;香豆素处理可显著增强灰葡萄孢霉菌的细胞膜透性,经香豆素处理48 h,灰葡萄孢霉菌的电导率为17568.79 μS/cm,为对照组电导率的1.9倍。可见,香豆素可以抑制灰葡萄孢霉菌的生长,使其呼吸代谢受阻,干扰灰葡萄孢霉菌细胞膜的渗透,抑制灰葡萄孢霉菌细胞壁酶的活性。该结果可为以香豆素为主的新型植物源农药开发以及灰霉病的防治提供理论支撑。     

啶酰菌胺与唑胺菌酯混配对灰葡萄孢毒力的增效作用

为明确啶酰菌胺与唑胺菌酯对灰葡萄孢Botrytis cinerea毒力的增效作用,采用菌丝生长速率法测定了啶酰菌胺与唑胺菌酯不同配比混合物对灰葡萄孢菌株DZ3(对多菌灵、乙霉威和嘧霉胺高抗)的毒力,以Wadley公式评价了其协同作用。选取最佳增效组合,采用黄瓜子叶喷雾法测定了其对其他5个菌株的毒力及田间防效。通过测定菌株DZ3分生孢子悬浮液中的溶氧量、电导率和菌丝中丙二醛的含量,研究最佳增效组合的增效机制。结果表明:啶酰菌胺与唑胺菌酯不同质量比(9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7和1∶9)的混合物均对菌株DZ3表现为毒力增效作用,其中质量比为1∶3的组合增效最明显,增效系数达4.76,且对另外5个供试菌株的联合毒力也表现出增效;在使用剂量为有效成分200~300 g/hm2时,质量比为1∶3的组合对番茄灰霉病的防治效果为78.05%~93.96%,同时其对菌株DZ3的呼吸抑制作用与单剂啶酰菌胺相当,但对细胞膜通透性和菌丝膜脂质过氧化的影响均显著高于各单剂。本研究结果表明,啶酰菌胺与唑胺菌酯以质量比1∶3进行混配,可用于番茄灰霉病的防治。     

番茄灰霉病菌对腐霉利的抗药性检测及生物学性状研究

采用区分剂量法,检测了来自福建省、上海市、辽宁省和内蒙古自治区不同采样点的番茄灰霉病菌Botrytis cinerea对腐霉利的抗性频率;选取未施药地区的敏感菌株,建立了灰霉病菌对腐霉利的敏感基线;比较了常年施药地区与未施药地区灰霉病菌的抗性频率差异,测定了施药10年以上地区番茄灰霉病菌的抗性指数;研究比较了抗、感菌株的生物学性状。结果表明:腐霉利对127株敏感菌株的平均EC50值为(0.31±0.08) μg/mL;供试4省市灰霉病菌对腐霉利均表现出了很高的抗性频率,其中内蒙古自治区和辽宁省采样点的抗性菌株频率高于90%;在施药历史超过10年的215株田间菌株中,抗性水平最高的菌株来自辽宁省,抗性指数为44.3;施药地区灰霉病菌的抗性频率均高于未施药地区;抗性菌株的抗药性可稳定遗传;供试11株抗性和敏感菌株在产孢量和孢子萌发率、菌丝生长速率、活体致病力等生物学性状方面的差异与其抗性水平之间无明显相关性。     

新型异丙醇三唑类杀菌剂氯氟醚菌唑

采用超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS),建立了香蕉、芒果果实中氯氟醚菌唑残留的检测方法,并依据NY/T 788—2018《农作物中农药残留试验准则》,开展了400 g/L氯氟醚菌唑悬浮剂 (SC) 1年6地的田间残留试验,研究了氯氟醚菌唑在香蕉、芒果果实中的消解动态和残留分布情况。样品经乙腈提取,GCB和C₁₈组合吸附剂净化,UPLC-MS/MS检测。结果表明：在0.001~1 mg/kg添加水平下,氯氟醚菌唑在香蕉全果和果肉中的平均回收率为83%~93%,相对标准偏差 (RSD) 为2.3%~5.9%;在芒果全果和果肉中的平均回收率为82%~91%,RSD为2.9%~6.0%。定量限 (LOQ) 均为0.001 mg/kg。田间试验结果显示：400 g/L氯氟醚菌唑SC按有效成分133.3 mg/kg施药3次,施药间隔7~10 d,距末次施药后21、28 d,氯氟醚菌唑在香蕉全果中的残留量为0.03~0.09 mg/kg,在香蕉果肉中的残留量为<0.001~0.004 mg/kg;按有效成分160 mg/kg施药3次,施药间隔7~10 d,距末次施药后14、21 d,氯氟醚菌唑在芒果全果中的残留量为0.04~0.28 mg/kg,在芒果果肉中的残留量为0.001~0.003 mg/kg。该研究结果可为指导氯氟醚菌唑在香蕉、芒果上的科学合理使用及制定其在香蕉、芒果上的最大残留限量 (MRL) 提供参考。

     

竹红菌甲素对番茄灰霉病菌的关键抑菌因子

为探究竹黄菌Shiraia bambuscola代谢产物竹红菌甲素(HA)对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的关键抑菌因子,依据活性氧淬灭原理,测定了HA的光反应类型;采用单线态氧(~1O_2)捕捉法、芬顿试剂法和核黄素光化学反应法,分析了单线态氧(~1O_2)、羟基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O_2~(-·)) 3种活性氧浓度与HA对番茄灰霉病菌抑制率的相关性。结果表明:HA是通过光动力作用中的2种光反应类型(TypeⅠ和TypeⅡ)产生的活性氧对番茄灰霉病菌起到抑制作用,其中主要以TypeⅡ为主。~1O_2、·OH和O_2~(-·)的浓度与其对番茄灰霉病菌的抑制率均呈极显著的线性正相关,3种活性氧均为关键抑菌因子。经回归分析,获得最优回归模型为:Y=0.055 9+0.814 5X_1+0.002X_2+0.738 4X_3,其中Y为抑制率,X_1、X_2和不分别为~1O_2、·OH和O_2~(-·)的浓度,R2=0.9619,可见三者抑菌能力顺序为~1O_2O_2~(-·)·OH。本论文首次提出HA抑制番茄灰霉病菌的关键因子,为HA作用机理的研究奠定了基础,并为其作为光活化农药的开发利用提供了理论依据。     

灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株的生物学特性

为明确灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株的生物学特性差异,将9个不同敏感型菌株在无药PDA平板上继代培养10代后,测定其对氟唑菌酰羟胺的敏感性。采用菌丝生长速率法分别在PDA平板和离体叶片上测定了其菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率和致病性,以及其对温度、pH值和葡萄糖的敏感性,并对其编码琥珀酸脱氢酶的SdhA、SdhB、SdhC和SdhD 4个亚基基因进行了克隆与测序。结果显示:从田间获得的2个低抗菌株、2个中抗菌株和2个高抗菌株对氟唑菌酰羟胺的敏感性变异指数在0.60~1.15之间,而通过室内药剂驯化获得的高抗菌株BLH5F对氟唑菌酰羟胺的敏感性变异指数为0.23;除低抗菌株WP8的菌丝生长速率显著低于2个敏感菌株,以及中抗菌株WP6和高抗菌株WPE9的产孢量显著低于2个敏感菌株外,其余各抗性菌株在菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率和致病性方面均无显著差异。整体而言,7个抗性菌株在对温度、pH值和葡萄糖的敏感性方面与敏感菌株无显著差异。基因克隆及测序结果表明,室内药剂驯化获得的高抗菌株BLH5F SdhB基因的272位由组氨酸变为了精氨酸 (H272R),田间获得的低抗、中抗和高抗各2个菌株均为SdhB基因的225位由脯氨酸变为了亮氨酸 (P225L)。综合分析表明,灰葡萄孢对氟唑菌酰羟胺不同敏感型菌株具有相似的适合度。因此,推测在药剂的选择压下,抗氟唑菌酰羟胺的灰葡萄孢菌株在田间容易形成优势种群。     

多菌灵等4种杀菌剂对烟草灰霉病菌的室内生物活性

采用菌丝生长速率法和孢子萌发法,分别测定了烟草灰霉病菌对多菌灵、嘧霉胺、异菌脲和丙环唑的敏感性,同时通过离体叶片法评估了这4种杀菌剂对烟草灰霉病的保护和治疗作用。结果表明:4种杀菌剂对烟草灰霉病菌的菌丝生长和孢子萌发均表现出了不同程度的抑制活性,并对灰霉病同时具有保护和治疗作用。其中多菌灵对菌丝生长的抑制活性最强,EC₅₀平均值为0.06 mg/L,其次为丙环唑、嘧霉胺和异菌脲,EC₅₀平均值分别为0.36、0.53和0.60 mg/L;异菌脲和丙环唑对烟草灰霉病菌孢子萌发的抑制活性较强,EC₅₀平均值分别为2.05和2.21 mg/L,其次为嘧霉胺和多菌灵,EC₅₀平均值分别为10.56和131.23 mg/L。异菌脲和多菌灵对灰霉病的保护作用和治疗作用均最强,当药剂质量浓度为200 mg/L时,其对离体叶片的保护和治疗作用防效分别为100%、100%和98.3%、91.8%。研究结果可为烟草灰霉病的科学防治提供依据。     

灰葡萄孢对腐霉利的抗性分子机制及快速检测技术

为明确灰葡萄孢Botrytis cinerea对腐霉利的抗性现状,于2017—2018年采用单孢分离法从浙江省5个地区的草莓大棚共分离获得200个菌株.通过区分剂量法测定了其对腐霉利的抗性,对抗药性菌株的分子机制进行了分析,并根据抗药性分子机制,建立了B.cinerea腐霉利高抗基因型的环介导等温扩增(loop-med...     

isopropylstilbene发酵条件优化及其对灰葡萄孢的抑制作用

isopropylstilbene (3, 5-二羟基-4-异丙基二苯乙烯) 是发光杆菌Photohabdus temperata产生的一种二苯乙烯类化合物,具有多种生物活性。为促进isopropylstilbene在农业抗生素领域应用价值的开发,采用固相萃取、柱层析等技术从发光杆菌P. temperata SN 35的发酵液中分离纯化得到1个化合物,通过核磁共振氢谱对其结构进行了确认,并采用高效液相色谱测定了其纯度;通过Plackett-Burman试验和响应面法对发光杆菌SN 35摇瓶发酵培养条件进行了优化,并初步研究了所分离化合物对灰葡萄孢Botrytis cinerea的离体抑菌活性及对灰霉病的防治效果。结果表明:所分离的化合物为isopropylstilbene,纯度为93%;对发光杆菌SN 35摇瓶发酵培养条件进行优化后,isopropylstilbene的产量是优化前的2.22倍。离体抑菌试验结果表明:isopropylstilbene对灰葡萄孢的菌丝生长具有较好的抑制作用,其EC₅₀值为 (9.17 ± 0.17) μg/mL,但低于对照药剂百菌清[EC₅₀值为 (0.90 ± 0.08) μg/mL];在10 μg/mL下,isopropylstilbene对灰葡萄孢孢子萌发的抑制率为63.01%。活体盆栽试验结果表明,在200 μg/mL下,isopropylstilbene对黄瓜灰霉病的防治效果达92.19%,与百菌清的防效 (97.63%) 相当,对番茄灰霉病的防治效果为72.12%,略低于百菌清 (81.61%)。本研究通过对isopropylstilbene发酵条件的优化,为其工业化生产奠定了理论基础。该化合物对灰霉病具有很好的防治效果,可为天然杀菌剂的研究与开发提供参考。     

樱桃灰霉病菌LFD-RPA快速检测方法的建立

 灰霉病是樱桃的主要病害,由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染所致。该病菌可为害樱桃的花、叶、果实等多个部位,尤其在樱桃生长中后期及贮藏期发病率极高,危害严重。依据樱桃灰霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立了樱桃灰霉病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。结果表明,该方法检测条件为37℃扩增30 min,能特异性地检测灰葡萄孢,灵敏度为100 fg·μL^-1,略低于常规PCR(10 fg·μL^-1)和荧光定量PCR(7.43 fg·μL^-1);检测方法用时短,PRA扩增仅需30 min,LFD检测仅需10 min。本研究建立的快速检测方法可用于樱桃灰霉病菌的实时监测及病害的田间快速诊断。     

上海地区草莓灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感性检测及抗性机制分析

为明确上海地区草莓灰霉病菌Botrytis cinerea Pers. 对主要防治药剂啶酰菌胺的敏感性水平及抗性机制,采用平皿法检测了采自上海市6个区县的195株草莓灰霉病菌株对啶酰菌胺的敏感性,并分析了其中20株不同敏感型菌株的琥珀酸脱氢酶基因序列。结果显示:啶酰菌胺对上海地区草莓灰霉病菌菌丝生长的EC₅₀最小值为0.15 μg/mL,最大值大于110 μg/mL;对孢子萌发的EC₅₀最小值为0.19 μg/mL,最大值大于50 μg/mL。上海地区草莓灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性频率为29.74% (抗性水平大于10),高抗频率为20.51% (抗性水平大于100)。该抗性的产生与琥珀酸脱氢酶SdhB亚基发生H272R或P225F突变有关,其中H272R突变发生较为普遍。研究表明,上海地区草莓灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性水平及抗性频率较高,主要抗性机制为病原菌琥珀酸脱氢酶SdhB亚基上的H272R突变。     

解淀粉芽孢杆菌LJ02对黄瓜抗灰霉病菌的生防效果及其诱导抗性机理的初步研究

 为了解生防解淀粉芽孢杆菌LJ02诱导黄瓜抗灰霉病菌的防治效果和作用机制,分别测量了LJ02的发酵上清液和菌体悬浮液的诱导持效期、最适使用浓度以及最佳施用方法,并采用荧光定量PCR的方法法测定了LJ02诱导处理后黄瓜根部和叶部组织中分别表达PR1a蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化物酶的抗性基因PR-1、PR-2、PR-3、PR-9的相对表达量。结果表明,LJ02诱导黄瓜抗灰霉病菌的持效期在7 d左右,且原液与100倍稀释液效果最好,灌根施用效果最佳。LJ02发酵上清液可诱导PR-1、PR-3、PR-9的表达,LJ02菌体悬浮液可诱导PR-1、PR-2、PR-3的表达。     

解淀粉芽孢杆菌LJ02对黄瓜抗灰霉病菌的生防效果及其诱导抗性机理的初步研究

 为了解生防解淀粉芽孢杆菌LJ02诱导黄瓜抗灰霉病菌的防治效果和作用机制,分别测量了LJ02的发酵上清液和菌体悬浮液的诱导持效期、最适使用浓度以及最佳施用方法,并采用荧光定量PCR的方法法测定了LJ02诱导处理后黄瓜根部和叶部组织中分别表达PR1a蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶、过氧化物酶的抗性基因PR-1、PR-2、PR-3、PR-9的相对表达量。结果表明,LJ02诱导黄瓜抗灰霉病菌的持效期在7 d左右,且原液与100倍稀释液效果最好,灌根施用效果最佳。LJ02发酵上清液可诱导PR-1、PR-3、PR-9的表达,LJ02菌体悬浮液可诱导PR-1、PR-2、PR-3的表达。     

番茄灰霉病菌对咯菌腈的抗性诱变及抗药突变体的生物学特性

为评估番茄灰霉病菌Botrytis cinerea对咯菌腈的抗性风险,就室内经紫外照射获得抗药突变体的方法及抗性突变体的生物学性状进行了研究。结果表明:番茄灰霉病菌分生孢子的紫外照射亚致死时间为90~120 s;经亚致死时间紫外照射后,4个亲本菌株中有2个菌株共产生了6个抗咯菌腈的突变体,其EC50值是亲本菌株的310倍以上,抗性突变频率为3.13×10-7;经紫外照射诱变获得的所有抗性突变体在菌丝生长速率、产孢量、产菌核能力及其在番茄果实上的致病性方面均比其亲本菌株明显降低。相关分析显示,所得抗咯菌腈突变体对氟啶胺、啶菌唑、啶酰菌胺和嘧霉胺无交互抗性。表明番茄灰霉病菌对咯菌腈的抗药性风险较低。     

福建省番茄灰霉病菌对氟啶胺敏感基线建立及与不同杀菌剂的交互抗性

为明确中国福建省番茄灰霉病菌对氟啶胺的敏感性及其与不同杀菌剂的交互抗性,采用菌丝生长速率法测定了106株采自福建省主要番茄产区的番茄灰霉病菌对氟啶胺的敏感性。结果表明,氟啶胺对福建省番茄灰霉病菌菌丝生长的EC50值在0.0037～0.0452 μg/mL之间,平均值为（0.0221 ±0.0098）μg/mL,其敏感性频率分布呈连续单峰曲线,符合正态分布,因此可将该EC50平均值（0.0221±0.0098）μg/mL作为福建省番茄灰霉病菌对氟啶胺的敏感基线,用于其田间抗药性监测。从106株菌株中选择15株对氟啶胺敏感性不同的菌株,测定了其对嘧霉胺、异菌脲、腐霉利和啶氧菌酯的敏感性。结果表明,供试5种杀菌剂对15株番茄灰霉病菌菌丝生长的平均抑制活性依次为氟啶胺 >异菌脲 >腐霉利 >啶氧菌酯 >嘧霉胺,氟啶胺与异菌脲、腐霉利、啶氧菌酯和嘧霉胺之间均不存在交互抗性。     

两种蚕豆赤斑病菌对常用杀菌剂的抗药性检测及比较

对采自浙江、湖北和安徽3省的蚕豆赤斑病样品进行了病原菌的分离和鉴定,采用菌丝生长速率法检测了引起赤斑病的2种病原菌——蚕豆葡萄孢Botrytis fabae和灰葡萄孢B.cinerea 的抗药性发生情况,并在离体条件下通过抗药性诱导试验比较了二者的抗药性风险。结果共分离得到153个菌株,其中蚕豆葡萄孢122株(占79.7%),灰葡萄孢31株(占20.3%)。共检测到37株多菌灵高水平抗药性菌株(其中蚕豆葡萄孢9株)和42株异菌脲低水平抗药性菌株(其中蚕豆葡萄孢17株);嘧霉胺对153个菌株的EC50值在0.01~5.13 μg/mL之间,平均EC50值为0.72±0.15 μg /mL;表明蚕豆赤斑病菌对常见杀菌剂已表现出一定的抗药性,且灰葡萄孢的抗药性问题比蚕豆葡萄孢要严重得多。抗药性诱导试验进一步证实,灰葡萄孢的抗药性风险明显高于蚕豆葡萄孢。