拟南芥开花抑制基因TFL1多克隆抗体的纯化与特异性检测

为了获得敏感性和特异性高的TFL1多克隆抗体,本研究构建了GST-TFL1和His-TFL1原核表达载体并转入大肠杆菌表达菌株BL21中。经IPTG诱导和蛋白纯化,成功获得了分子量约为46kD的GST-TFL1和22kD的His-TFL1融合蛋白。利用纯化的融合蛋白His-TFL1作为抗原免疫,获得了TFL1的多克隆抗体血清。抗体血清经偶联了GST-TFL1融合蛋白的纯化基质进行免疫亲和纯化获得了纯化的TFL1多克隆抗体。免疫印迹检测抗体敏感性和特异性发现,纯化后的抗体不仅能特异地识别细菌内纯化的GST-TFL1和His-TFL1融合蛋白,也能与拟南芥中TFL1蛋白发生特异性反应。该研究结果为深入研究TFL1抑制植物开花的分子机制提供了有力的工具。     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。     

水稻SDG723蛋白C末端原核表达及多克隆抗体制备

水稻SDG723蛋白含有植物组蛋白甲基转移酶保守的SET结构域。选取其抗原决定簇较密集的C末端进行原核表达,通过构建原核表达载体pET28a-723C,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达融合蛋白后进行纯化。以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体。Western-blot分析表明,制备的多克隆抗体能有效地检测抗原的表达,为进一步深入研究SDG723蛋白的功能奠定了基础。     

斑马鱼血管新生相关因子PTPRB的原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】原核表达斑马鱼（Danio rerio）蛋白酪氨酸磷酸酶受体B（PTPRB）并制备多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB基因功能及血管发育相关信号传导通路打下基础。【方法】采用无缝克隆技术将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m构建重组表达质粒,转化大肠杆菌B21感受态细胞后采用IPTG进行诱导表达,然后以诱导表达的融合蛋白免疫大耳兔制备多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性及免疫效价。【结果】斑马鱼PTPRB蛋白亲水性均值为-0.490,属于亲水性蛋白,且具有较丰富的潜在抗原表位位点,分布均匀,无典型的跨膜区。将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m成功构建获得重组表达质粒pET-B2-PTPRB,转化B21感受态细胞后经IPTG诱导表达,即获得35.0 kD的融合蛋白。融合蛋白PTPRB主要以包涵体形式存在;以纯化融合蛋白PTPRB免疫大耳兔,其血清抗体效价为1∶2048000,说明采用融合蛋白PTPRB可有效刺激大耳兔产生较强的免疫反应,获得较高效价的PTPRB多克隆抗体。Western blotting检测结果显示,PTPRB多克隆抗体具良好抗原特异性。采用Protein A/G亲和层析柱对制备获得的PTPRB多克隆抗体进行亲和层析纯化,可获得高纯度的多克隆抗体,纯化后的PTPRB多克隆抗体浓度在10 mg/mL以上。【结论】构建的斑马鱼PTPRB基因原核表达载体能高效表达具备良好免疫原性的融合蛋白PTPRB,以融合蛋白PTPRB免疫大耳兔可获得高效价、高特异性的PTPRB多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB蛋白功能提供有利工具,也为揭示PTPRB在鱼类血管发育中的作用机制提供技术支持。     

尼罗罗非鱼Lck多克隆抗体的制备及鉴定

[目的]制备及鉴定尼罗罗非鱼淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)多克隆抗体,为深入研究罗非鱼Lck蛋白功能及其免疫机制打下基础.[方法]采用无缝克隆技术构建重组质粒pET-B2m-Lck,然后转入大肠杆菌B21(DH3)中进行诱导表达;经Ni-NTA树脂层析柱纯化后,以纯化的融合蛋白免疫日本大耳白兔制备Lck多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性和免疫效价.[结果]尼罗罗非鱼Lck蛋白的亲水性均值(GRAVY)为-0.454,属于亲水性蛋白,具有较丰富且分布均匀的潜在抗原表位位点,无典型的跨膜区.经原核载体诱导表达获得的融合蛋白分子量约67.0 kD,主要以包涵体形式存在.免疫日本大耳白兔后可获得效价为1:256000的Lck多克隆抗体,且该多克隆抗体能特异性识别Lck蛋白.经Protein G亲和层析柱纯化的抗体浓度在10 mg/mL以上,纯度约95%,抗体纯化效果良好.[结论]经原核载体诱导表达获得的尼罗罗非鱼Lck融合蛋白具有良好的免疫原性,其免疫日本大耳白兔后获得的多克隆抗体具有高效价和特异性,可用于细菌感染罗非鱼后机体免疫机制的研究.     

应用Intein融合的鸡IL-2蛋白制备多克隆抗体

研究Intein标签与目的蛋白chIL-2融合作为抗原,进行高效价兔抗chIL-2蛋白多克隆抗体的制备,将去除去了N-端信号肽的chIL-2基因(366 bp)克隆连接到p TYB1原核表达载体,将chIL-2基因与1 362 bp的Intein基因融合在同1开放阅读框内,编码分子量约为71 ku的chIL-2-Intein融合蛋白。诱导表达chIL-2-Intein融合蛋白,应用Chitin-Sepharose亲和层析进行融合蛋白纯化。用纯化的chIL-2-Intein融合蛋白免疫大白兔制备多克隆抗体。应用昆虫细胞表达系统纯化出的chIL-2-6His蛋白作为抗原,包被ELISA板用于抗体效价的检测,Western Blot分析抗体特异性。结果表明:应用纯化的chIL-2-Intein融合蛋白成功制备特异性chIL-2抗体,效价高达4 096 000,且该抗体也能用于Intein标签蛋白的检测。     

拟南芥Mg2+转运蛋白AtMGT10的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】在大肠杆菌系统中原核表达拟南芥叶绿体Mg~(2+)转运蛋白AtMGT10,通过免疫健康成年家兔,获得针对AtMGT10蛋白的多克隆抗体,为研究AtMGT10蛋白在植物生长发育中的功能奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆AtMGT10基因编码区187~786bp的cDNA片段,连接到pET-28a中构建原核表达载体pET-28aAtMGT10~(63-262),转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达带有His标签的His-AtMGT10~(63-262)截短重组蛋白。用镍柱亲和纯化后的重组蛋白作为抗原皮下注射免疫家兔,制备针对AtMGT10蛋白的多抗血清。提取拟南芥野生型叶片总蛋白,用AtMGT10多抗血清进行蛋白免疫印迹检测。【结果】经PCR扩增获得了600bp的AtMGT10基因cDNA片段,成功构建原核表达载体pET-28a-AtMGT10~(63-262),在大肠杆菌系统中表达出His-AtMGT10~(63-262)蛋白,经亲和纯化后免疫家兔获得了Anti-AtMGT10多抗血清。在拟南芥野生型总蛋白中用Anti-AtMGT10经免疫印迹检测到大约50ku的蛋白条带,利用抗原竞争试验进一步证明检测到的信号就是拟南芥内源AtMGT10蛋白。【结论】原核表达了His-AtMGT1063-262蛋白,成功制备了特异性较强的AtMGT10蛋白多克隆抗体。     

猪Jiv基因的克隆表达与多克隆抗体制备

【目的】克隆猪Jiv蛋白核心区的2 112bp的基因片段,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达和纯化,制备抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。【方法】利用RT-PCR方法,从猪脾脏组织RNA中扩增得到猪Jiv基因,将其克隆到pMD19-T载体并测序,以此为基础构建原核表达载体pET32a-Jiv,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,利用IPTG诱导表达,获得大量包涵体形式的猪Jiv融合蛋白。通过镍离子螯合层析柱对表达的目的蛋白进行纯化,对纯化后的包涵体蛋白进行透析复性,以每只新西兰白兔400μg蛋白的初次免疫剂量和500μg蛋白的加强免疫剂量进行免疫,共免疫5次,采集血清,采用间接ELISA法检测抗体效价达到一定水平后,收集抗体,利用Western blot检测抗体特异性。【结果】克隆得到长度为2 112bp的猪Jiv基因片段;构建的pET32a-Jiv在E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中经诱导后高效表达,SDS-PAGE结果显示,纯化得到分子质量约为95ku的猪Jiv融合蛋白;测得的猪Jiv蛋白多克隆抗体效价达1∶6 400;Western blot检测结果证实,所获得抗体能够有效地应用于猪Jiv蛋白抗原的检测。【结论】成功地克隆了猪Jiv基因,制备了抗猪Jiv蛋白的多克隆抗体。     

中华鳖白细胞介素17原核表达及多克隆抗体制备

构建中华鳖白细胞介素17(IL17)原核表达载体pET28a-IL17,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到融合蛋白HIS-IL17。以Ni-NTA柱纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰兔4次,制备抗血清,用Protein A/G纯化后得到多克隆抗体。免疫印迹结果显示,制备的多克隆抗体与纯化蛋白可发生特异性反应。本试验成功制备了中华鳖IL17蛋白多克隆抗体,为研究IL17在中华鳖免疫系统中的作用奠定了基础。     

BLCAP蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

目的:利用原核表达系统表达BLCAP融合蛋白并制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a( )-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达并采用亲和层析的方法纯化和SDS-PAGE鉴定后免疫日本大耳白兔,制备BLCAP蛋白多克隆抗体并检测其特异性。结果:经过IPTG诱导,获得分子量大小约为28ku的融合蛋白,用纯化得到的融合蛋白免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP蛋白的多克隆抗体,通过Western blot检测证明该抗体能够与BLCAP融合蛋白发生特异性结合。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性,制备的抗BLCAP的多克隆抗体特异性较好,为今后进一步研究BLCAP蛋白性质与功能奠定了基础。     

北柴胡转录因子BcAP2-13的原核表达 和多克隆抗体制备

利用带有促溶标签SUMO和纯化标签6×His的原核表达载体,构建了调控北柴胡皂苷生物合成的转录因子基因BcAP2-13的原核表达载体p13-SUMO-His6。载体热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导培养,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,28℃和37℃不同温度诱导条件下均得到了融合蛋白13-SUMO-His 6。以Ni-NTA柱纯化的融合蛋白为抗原,免疫成年兔4次以制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测结果表明,所得抗体效价较高。提取北柴胡毛状根及BcAP2-13超表达毛状根的总蛋白,免疫印迹检测结果表明,在2种毛状根蛋白样品中均能检测到与预计13-SUMO-His6蛋白分子量大小一致的条带,BcAP2-13过表达毛状根总蛋白样品的条带强于普通毛状根总蛋白样品的条带,与预期一致。成功制备了北柴胡BcAP2-13的多克隆抗体,为进一步研究北柴胡转录因子BcAP2-13的确切作用位点和调控机制奠定了基础。     

水稻SDG711蛋白C末端原核表达及多克隆抗体制备(英文)

[目的]对水稻SDG711蛋白C末端进行原核表达,并制备其多克隆抗体。[方法]选取水稻SDG711蛋白抗原决定簇较密集的C末端进行原核表达,通过构建原核表达载体pET28a-711C,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达融合蛋白后进行纯化,再以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,并对其进行Western-blot分析。[结果]试验制备的多克隆抗体能有效地检测抗原的表达。[结论]该研究为进一步深入研究SDG711蛋白的功能奠定了基础。     

水稻SDG711蛋白C末端原核表达及多克隆抗体制备

[目的]对水稻SDG711蛋白C末端进行原核表达,并制备其多克隆抗体。[方法]选取水稻SDG711蛋白抗原决定簇较密集的C末端进行原核表达,通过构建原核表达载体pET28a-711C,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达融合蛋白后进行纯化,再以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,并对其进行Western-blot分析。[结果]试验制备的多克隆抗体能有效地检测抗原的表达。[结论]该研究为进一步深入研究SDG711蛋白的功能奠定了基础。     

团头鲂转录因子Oct4的原核表达和多克隆抗体的制备

为进一步分析鱼类干细胞多能性转录因子Oct4的功能,将团头鲂(Megalobrama amblycephala)Oct4进行原核表达并制备了兔抗Oct4多克隆抗体。采用RT-PCR方法从团头鲂卵巢中扩增Oct4基因的部分编码片段,插入载体pET32a中构建重组原核表达载体pET32a-MaOct4;将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导、Ni~(2+)亲和柱层析纯化获得分子量约49 ku的可溶性重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备抗体,通过ELISA法测定其效价,Western blot鉴定其特异性。实验结果表明:该重组载体在37℃,0.5 mmol/L IPTG条件下诱导4 h可获得Ma-Oct4重组蛋白的高效表达;制备的团头鲂Oct4多克隆抗体能够分别与纯化的Oct4蛋白、原核表达的Oct4蛋白、团头鲂胚胎中的内源Oct4蛋白以及HepG2细胞中过表达的Ma-Oct4:DsRed融合蛋白特异结合。为后续深入研究团头鲂Oct4在干细胞多能性调控中的作用提供了有效的分子工具。     

小麦DREB4蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

DREB(dehydration responsive element binding)转录因子在小麦非生物胁迫中起着非常重要的作用，但由于目前缺乏可识别小麦内源性DREB蛋白的抗体，导致其在蛋白水平上的研究进展非常缓慢。本研究通过分析DREB4A、4B和4C三种蛋白序列，将DREB4A在大肠杆菌中进行表达，并利用纯化后的蛋白作为抗原免疫兔子，在国内外首次获得小麦DREB4的多克隆抗体。Western blot结果证明，该抗体可特异性识别小麦内源性DREB4蛋白。该抗体介导的免疫组织化学结果显示，DREB4蛋白定位于细胞核内。本研究为深入研究植物DREB信号通路提供了有力的检测工具。     

马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)外壳蛋白基因的克隆、表达及其间接ELISA方法的建立

【目的】制备马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVY^N）多克隆抗体,建立间接ELISA法用于检测PVY^N病毒。【方法】依据PVY^N的CP基因序列设计引物,利用RT-PCR方法获得CP基因并连接构建到原核表达载体,进行原核表达,以纯化的重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,获得PVY^N的抗血清并纯化。【结果】测序结果与其他已知序列比较,PVYNCP基因的核苷酸同源性95%,推断氨基酸的同源性达98%。以纯化蛋白为抗原进行免疫,成功获得了PVY^N外壳蛋白抗血清,纯化后的IgG采用间接ELISA法检测抗原,抗体效价达1：500,使用该抗体稀释度检测感染植株,结果呈阳性。【研究结论】通过分子生物学途径获得了PVY^N的多克隆抗体,建立的间接ELISA方法可以用于PVY^N的病毒检测。     

Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF6多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）ORF6多克隆抗体,为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析CyHV-2的ORF6基因序列信息,采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段,将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白。以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制备ORF6多克隆抗体,并通过Western blotting和间接免疫荧光技术鉴定ORF6多克隆抗体的特异性。【结果】CyHV-2的ORF6基因全长3003 bp,与CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00%,其中与CyHV-3的相似性高达39.36%;其抗原表位最可能存在于第1~300位氨基酸序列中。将PCR扩增获得的ORF6基因片段连接至原核表达载体pET-28a可成功构建重组质粒pET-28a-ORF6,转化BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导4 h即获得融合蛋白ORF6;原核表达的融合蛋白ORF6主要以包涵体形式进行表达,其分子量为17.13 kD,经6 mol/L尿素洗涤纯化后的浓度为0.1 mg/mL。以纯化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制备获得的ORF6多克隆抗体能特异性识别融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的异育银鲫尾鳍细胞（GiCF）;利用制备的ORF6多克隆抗体对CyHV-2感染GiCF细胞进行间接免疫荧光分析,结果在CyHV-2感染GiCF细胞周围能观察到特异性绿色荧光,而在未感染CyHV-2的GiCF细胞周围未观察到特异性绿色荧光,进一步说明ORF6多克隆抗体可特异性识别CyHV-2。【结论】制备获得的ORF6多克隆抗体能与CyHV-2感染GiCF细胞发生特异性免疫反应,即可用于鉴定CyHV-2感染,为探究ORF6蛋白功能是否与CyHV-2潜伏感染相关打下了基础。     

拟南芥ERA-1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

将拟南芥ERA-1基因除信号肽外的剩余编码序列克隆到原核表达载体p ET28a上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,发现表达的目的蛋白位于包涵体中,大量表达目的蛋白并用镍柱亲和层析法进行纯化,获得足量的重组蛋白后将其作为抗原免疫家兔,获得抗血清。用重组蛋白亲和纯化抗血清中的ERA-1多克隆抗体。利用野生型拟南芥、ERA-1敲除突变系和ERA-1过表达系的叶片总蛋白进行免疫印迹试验,检测ERA-1多克隆抗体的特异性,发现纯化后的ERA-1多克隆抗体(1∶1 000体积比稀释)能特异地检测到拟南芥中的ERA-1蛋白。本试验成功制备了ERA-1蛋白的多克隆抗体,可以用于今后对ERA-1基因功能的研究。     

小鼠TRIM59蛋白多克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

【目的】制备兔抗鼠三结构域蛋白59(Tripartite motif-containing 59,TRIM59)多克隆抗体。【方法】利用PCR方法得到小鼠TRIM59基因片段,将其克隆至pGEX-2T原核表达载体中,转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达GST-TRIM59融合蛋白。GST-TRIM59融合蛋白经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA测定兔抗鼠TRIM59多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性。用免疫组织化学方法检测TRIM59在小鼠前列腺癌组织中的表达。【结果】成功构建了pGEX-2T-TRIM59原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-TRIM59融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体。ELISA测定结果表明,TRIM59多克隆抗体效价为1∶106以上;Western blot分析表明,TRIM59多克隆抗体具有良好的特异性。免疫组织化学检测发现,TRIM59在小鼠前列腺癌组织细胞中高表达。【结论】成功地制备了特异性良好的兔抗鼠TRIM59多克隆抗体,其具有良好的免疫学活性,能够用于相关研究。     

猪链球菌2型胞外因子的融合表达及多克隆抗血清的制备

根据GenBank SS2(Streptococcus suis serotype 2,SS2)epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,同时亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX4T-2上,将构建的原核表达质粒pGEx4T-2-epf导入大肠杆菌(Eacterium coli)TG1中,诱导融合蛋白EF-GST的表达.经亲和层析、凝血酶切割后,获得纯化的EF为抗原蛋白,用其免疫家兔制备抗血清,成功制备了EF蛋白及其特异的多克隆抗体,为进一步研究EF的功能提供了有用的工具.