利用双荧光素酶报告系统鉴定靶向作用猪CD163基因的miRNA

为了进一步筛选获得抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的候选mi RNA,为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)防治及猪的抗病育种提供新策略,通过3′RACE(Rapid-amplification of c DNA ends)测序获得了猪CD163基因3′UTR的完整序列,生物信息学分析发现其具有mi R-181c、mi R-181d、mi R-23b、mi R-4262等mi RNA的作用靶点。利用双荧光素酶报告系统检测发现,与阴性对照组相比,mi R-181c、mi R-181d、mi R-23b和mi R-4262均可极显著(P0.01)抑制荧光素酶的相对活性,其中mi R-181d抑制效果最佳。     

CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞的影响

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪子宫内膜内皮细胞的机制,研究了CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞的影响。将CD163分子转染猪子宫内膜内皮细胞,构建稳定表达CD163分子的猪子宫内膜内皮细胞系,用0.1 MOI的VR2332株PRRSV感染表达CD163分子的猪子宫内膜内皮细胞,收获不同感染时间的子代病毒并测定病毒滴度。结果显示,同一时间点CD163转染细胞组的PRRSV子代病毒滴度与空载体转染细胞组无明显差异。可见,CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞无明显作用。     

猪CD151重组抗原表达及其免疫血清的PRRSV感染抑制作用

用RT-PCR从猪巨噬细胞中扩增CD151胞外区编码序列,将其插入含细胞毒性T细胞相关抗原4胞外区序列的表达载体,重组载体转化大肠杆菌,SDS-PAGE检测重组蛋白表达;用包涵体纯化和尿素变性与复性法获得可溶性蛋白,纯化蛋白免疫小鼠,ELISA测定免疫血清抗体效价,Western-blot验证免疫血清特异性;以处理细胞或处理病毒方式,用免疫血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染抑制试验。结果表明:重组菌表达预期的32ku重组蛋白,获得的可溶性重组蛋白纯度较高;免疫血清抗体效价达1∶170 000,在猪巨噬细胞中能检测到预期的29ku蛋白,能抑制PRRSV感染MARC-145细胞,但有毒株差异性,处理病毒的感染抑制作用较强。结果提示猪CD151免疫血清能以结合细胞和结合病毒方式抑制PRRSV感染。     

内含子及其在基因表达中的作用

研究者对基因组序列功能的研究主要集中在编码序列,但随着基因组计划的完成,对内含子及基因间序列功能的研究也越来越受到重视,介绍了内含子的结构、功能、机理及应用研究进展.     

PRRSV感染对PAM IFI30基因表达的影响

干扰素γ诱导蛋白30(interferon,gamma-inducible protein 30,IFI30)在MHC-Ⅱ限制性抗原加工递呈过程和MHC-Ⅰ限制性抗原交叉递呈过程中起关键性作用。利用3个不同浓度PRRSV感染猪肺支气管巨噬细胞(PAM),应用qPCR在不同时间点检测IFI30基因表达水平。结果表明:0.08,0.10,0.12 MOI 3个剂量PRRSV感染PAM,IFI30基因表达差异不显著(P0.05);PRRSV感染1.5 h IFI30表达量降低,但差异不显著(P0.05),之后表达量上调;在感染后12,24,36 h IFI30基因表达量极显著提高(P0.01),之后IFI30基因表达量有所下降(P0.05)。IFI30基因在PRRSV感染PAM过程中表达量的变化,可能是PRRSV与宿主相互作用的机制之一。     

PRRSV细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体的制备

【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA,通过RT-PCR方法获得CD163SRCR5-SRCR6(第1 417~2 136bp,共720个bp)基因,将其克隆到pET-28a(+)载体上,构建重组表达载体pET-28a(+)-CD163,经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌,在BL21(DE3)中诱导重组目的蛋白表达,然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价,并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720bp的CD163SRCR5-SRCR6基因,成功构建了pET-28a(+)-CD163重组表达载体;SDS-PAGE结果表明,CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达;Western blot结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性,间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105;IFA试验结果显示,制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合,且在1∶20、1∶40倍稀释时,能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163SRCR5-SRCR 6重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体,其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。     

NMHC-ⅡA在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用

借用PRRSV结构蛋白GP5的抗独特型抗体Mab2-5G2,提取并纯化非肌肉肌球蛋白重链IIA(NMHC-ⅡA);通过激光共聚焦技术定位NMHC-ⅡA在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的分布;并采用免疫共沉淀技术研究其与PRRSV受体CD163的相互作用。结果表明:NMHC-ⅡA在Marc-145细胞内的表达量随着细胞被病毒感染时间的延长而增加,当PRRSV完全进入细胞后,NMHC-ⅡA的表达量有所降低;NMHC-ⅡA与PRRS病毒受体CD163存在相互作用,作用位点在M1(20—259 aa)和M3(714—1 040 aa)上。试验证明,NMHC-ⅡA在PRRSV感染过程中可能起协同作用。     

植物miRNA在应答非生物胁迫上的调控作用

植物miRNA是由约19-25个核苷酸组成的非编码单链小RNA,其表达不受翻译过程的影响,比编码基因更迅速,对目标基因表达的调控效率更高。近年研究证明,miRNA在植物应答非生物胁迫中发挥着重要作用。本文基于国内相关文献报道,阐述了植物miRNA的合成及作用机制,miRNA对水分、温度、高盐及氧化等非生物胁迫的应答反应,以及miRNA对营养亏缺的调节机制,并对这些研究领域所存在的问题和发展趋势进行了讨论,以期为全面认识植物的抗逆分子机理提供新信息。     

miRNA对完全变态昆虫发育的调控作用研究进展

昆虫尤其是完全变态昆虫的发育过程是一个复杂的网络调控过程,仍有很多问题尚待解决。miRNA是近年来发现的在真核生物中普遍存在的一类19~25 nt微小RNA分子,在转录后水平上发挥重要作用,广泛参与多种重要生物学过程。综述了近年来miRNA在调控完全变态昆虫(果蝇、家蚕、伊蚊、按蚊等)胚胎发育、组织分化以及变态发育等方面的研究进展,以期为深化理解昆虫变态发育机制、发现新的生物防控靶标分子奠定基础。     

猪长链非编码RNA lnc-000649在PRRSV感染增殖中的作用

长链非编码RNA(lncRNA)在免疫及病毒与宿主互作中发挥重要作用.本研究在猪PAM细胞中发现一种新的猪长链非编码RNA tnc-000649,其全序列长1 483 bp.利用荧光定量PCR技术检测了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染前后PAM细胞中lnc-000649的表达水平,发现其在PRRSV感染后表达显...     

两品种鸭下丘脑miRNA的鉴定及其表达验证分析

为了鉴定与鸭性成熟启动相关的miRNA,根据鸭卵巢组织的发育情况,利用Solexa技术分别对105日龄连城白鸭和樱桃谷鸭的下丘脑组织进行小RNA测序分析。两个小RNA文库共检测到939个成熟miRNA,共有miRNA数量806个。以樱桃谷鸭为对照,两个文库之间总共检测到290个差异表达miRNA,其中上调miRNA 85个,下调miRNA 205个。靶基因预测分析结果表明,较多的靶基因被注释到神经活性配体-受体相互作用、黏着斑、MAPK信号通路、胞吞作用等通路中。定量PCR结果表明,2个差异表达miRNA靶基因的mRNA表达量在两品种鸭下丘脑组织中存在着极显著差异。     

植物miRNA在植物生长发育中的作用研究

对植物miRNA的特点、生物合成过程、作用机制和发育调控进行了综述。     

miRNA在植物适应土壤胁迫中的作用

基本养分缺乏和含有有毒元素的土壤全球范围内广泛存在,严重影响作物生产。为了减少土壤胁迫的伤害,植物进化了适应不良土壤环境的机制。研究发现植物miRNA在植物适应土壤胁迫中具有重要作用。总结了在植物响应土壤养分缺乏胁迫和土壤元素毒害胁迫中植物miRNA的作用,强调植物miRNA在胁迫响应调控网络中的作用,提出改良植物不良土壤适应能力的思路。     

酵母基因表达调控关系的构建及其统计特性分析

[目的]从复杂网络的角度研究酵母细胞周期调控网络的统计特性。[方法]首先对酵母的细胞周期基因表达数据采用皮尔逊相关性度量,计算基因间的关联矩阵,即建立简单的基因调控网络;同时为了能够得到在宏观角度对大规模的基因调控有一个全貌的了解,进一步分析所建立调控网络的统计特性,通过计算所建立网络的统计特性：即计算网络的聚类系数、平均路径长度和网络的度分布。[结论]发现所建立的网络具有无标度和小世界特性,即所建立的酵母基因调控网络属于复杂网络,这为进一步深入研究基因调控网络的统计学和动力学特性打下了基础。     

营养因子对动物基因表达的调控作用

近些年来,越来越多的学者开始研究营养因子对基因表达的调控作用。基于这方面的研究资料,综述葡萄糖、脂肪和多不饱和脂肪酸、蛋白质及氨基酸、维生素A、D、E、B2、B6、C、生物素、叶酸、锌和铁等营养因子对基因表达的调控作用,以期初步揭示营养在动物生存和生产中的本质作用。     

miRNA及其靶基因调控植物根系生长发育的研究进展

为阐明microRNA(miRNA)及其靶基因调控植物根系生长发育的分子机制,依据PubMed、Web of Science和中国知网数据库,以“miRNA”、“植物”和“根系”为关键词,检索了1993—2021年发表的相关文献,进行整理和归纳,分析了miRNA及其靶基因对植物根系的调控机理。结果表明：1）根系生长发育是一个复杂且高度有序的生物学过程,众多的miRNA及其靶基因参与调控。2)miRNA通过互补配对的方式对靶基因进行转录切割或翻译抑制,在转录后水平调控根系生长发育相关基因的表达。3)miRNA介导的根系生长发育调控在主根生长、侧根形成、不定根发育、根系形态结构、维管束形态、植物激素诱导、生物和非生物胁迫响应等方面发挥着重要的调控作用。     

藜麦miRNA及其调控靶基因的全基因组预测与分析

[目的]microRNAs(miRNAs)是一类大小为21 nt左右的内源性非编码小分子RNA,可在转录后水平通过调控基因的表达。本研究预测藜麦miRNAs及其靶基因,旨在为今后miRNAs在藜麦中的生物学功能解析奠定理论基础。[方法]基于miRNAs在物种间的保守性,将miRBase数据库中已知的植物miRNAs与藜麦基因组进行同源比对,按照miRNA的判定标准进行cqu-miRNAs的筛选;以藜麦的转录组序列为参照,利用psRNAtarget预测cqu-miRNAs的靶基因;利用TBtools对靶基因进行GO功能注释和功能富集分析。[结果]本研究共预测到分别属于4个miRNAs家族的8条cqu-miRNAs,它们的前体序列均能形成稳定的二级结构;靶基因预测结果表明8条cqu-miRNAs可作用于217个靶基因。GO功能注释和功能富集分析发现这些miRNAs的靶基因广泛参与了基因转录调控、细胞代谢、信号转导等生物学过程。[结论]本研究首次从全基因组水平预测到了8条cqu-miRNAs;靶基因功能富集分析发现这些cqu-miRNAs作用的217个靶基因广泛参与藜麦生长发育、胁迫应答和次生代谢途径,以上结果为进一步研究miRNAs在藜麦中的调控作用提供了理论基础。     

稳定表达猪miRNA let-7c细胞株的建立及其对CSFV的调控作用

【目的】构建含有let-7c前体基因的重组质粒pGene-pre-let-7c,建立稳定表达猪miRNAlet-7c细胞株,研究let-7c对猪瘟病毒(CSFV)复制的调控作用。【方法】利用RNA22软件筛选出CSFV基因组3′-UTR潜在的let-7c结合位点,PCR扩增出let-7c前体片段,连接到表达载体pGenesil-1.1-dBm2上,构建重组质粒pGene-pre-let-7c,采用脂质体法将重组质粒转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),经G418抗性压力筛选获得阳性细胞株。对获得的阳性细胞株进行接毒试验,检测CSFV的复制情况。用MTT比色法检测阳性细胞的增殖情况。【结果】成功扩增出let-7c前体基因,并构建了pGene-pre-let-7c重组质粒。重组质粒转染SUVEC细胞后筛选获得了稳定表达let-7c的细胞株。let-7c可下调CSFV在细胞中的复制。【结论】let-7c可下调CSFV的RNA复制水平。     

自由基种类及其在植物抗病分子调控中的作用

当生物生命代谢中受到各种应激时,由于出现了超量的具有高度活性的自由基,因而使其代谢发生重大变化。研究表明,植物在各种逆境下在细胞内产生的诸如氧化氮、单线态氧、过氧化氢等活性氧自由基对植物抗逆性调控因子的表达和细胞死亡调控具有重要意义。本文对植物逆境代谢中产生的自由基种类及其性质、抗氧化酶种类及其基因的多态性进行了总结,同时对部分重要的自由基对植物抗病基因表达的调控作用和对细胞死亡的调控作用进行了表述。     

基因表达系列分析技术在植物基因表达分析中的应用

 基因表达系列分析技术 (SAGE)是一种以测序为基础 ,采用数字化分析手段 ,在转录物水平上研究细胞或组织基因表达模式的有效工具。该技术不仅能够全面地分析特定组织或细胞表达的基因 ,获得这些基因表达丰度的数量信息 ,还可比较不同组织、不同时空条件下基因表达的差异 ,从而发现新基因。SAGE技术在植物方面的应用相对较少 ,但进展很快。本文着重介绍了SAGE在植物基因表达分析中的应用 ,分析SAGE所存在的问题、改进方法及发展前景