利用双荧光素酶报告系统鉴定靶向作用猪CD163基因的miRNA

为了进一步筛选获得抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的候选mi RNA,为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)防治及猪的抗病育种提供新策略,通过3′RACE(Rapid-amplification of c DNA ends)测序获得了猪CD163基因3′UTR的完整序列,生物信息学分析发现其具有mi R-181c、mi R-181d、mi R-23b、mi R-4262等mi RNA的作用靶点。利用双荧光素酶报告系统检测发现,与阴性对照组相比,mi R-181c、mi R-181d、mi R-23b和mi R-4262均可极显著(P0.01)抑制荧光素酶的相对活性,其中mi R-181d抑制效果最佳。     

CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞的影响

为探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染猪子宫内膜内皮细胞的机制,研究了CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞的影响。将CD163分子转染猪子宫内膜内皮细胞,构建稳定表达CD163分子的猪子宫内膜内皮细胞系,用0.1 MOI的VR2332株PRRSV感染表达CD163分子的猪子宫内膜内皮细胞,收获不同感染时间的子代病毒并测定病毒滴度。结果显示,同一时间点CD163转染细胞组的PRRSV子代病毒滴度与空载体转染细胞组无明显差异。可见,CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞无明显作用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CD163受体功能域鉴定

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染易感细胞受体。研究表明CD163受体的前2个SRCR区域与PRRSV感染无关。为确定PRRSV感染细胞过程中CD163受体关键SRCR区域,构建表达野生型CD163受体和缺失不同个数SRCR区域的CD163受体突变体质粒。将质粒转染BHK-21细胞24 h后,XH-GD株PRRSV感染细胞,进行间接免疫荧光(IFA)观察。结果显示,CD163前4个SRCR重复区缺失不影响PRRSV感染,SRCR5是PRRSV感染细胞所必须。为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用及与其他受体之间相互关系提供试验基础。     

Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一.从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切位点将CD163基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcDNA3.1-CD163,并将重组质粒pcDNA3.1-CD163在BHK细胞上进行表达鉴定.结果表明,Marc-145细胞CD163蛋白在BHK细胞中得到了表达.这为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据.     

Marc-145细胞CD163基因克隆及其真核表达质粒构建

猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,CD163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一。从Marc-145细胞克隆出CD163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点CD163 ORF基因,通过HindⅢ和XhoⅠ双酶切位点将CD163基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcDNA3.1-CD163,并将重组质粒pcDNA3.1-CD163在BHK细胞上进行表达鉴定。结果表明,Marc-145细胞CD163蛋白在BHK细胞中得到了表达。这为进一步研究CD163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据。     

热应激奶牛血清miRNA表达谱及miR-181a靶基因分析

通过分析热应激奶牛和正常奶牛血清差异表达miRNA,及对重要的候选miRNA进行靶基因预测及相关生物信息学分析,探索miRNA在荷斯坦奶牛发生热应激过程中的作用及其调控机制。利用miRNA高通量测序技术对奶牛血清中miRNA表达谱进行检测和分析以筛选差异表达miRNA;用RT-qPCR方法验证4个在热应激奶牛血清与正常奶牛血清中显著差异表达的候选miRNAs;采用Targetscan生物信息学计算方法预测目标miR-181a(对应激以及免疫反应可能起重要调节作用)的靶基因,并对靶基因进行GO注释描述、富集分析及KEGG富集。结果表明:miRNA高通量测序分析发现共有52个差异表达极显著miRNA(P0.01)。候选的4个miRNAs(miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-1246)的RT-qPCR检测结果与测序分析结果具有很好的一致性。GO和KEGG分析结果显示,miR-181a的靶基因与应激反应以及免疫功能密切相关,并且靶基因在B细胞和T细胞受体信号通路中显著富集。结论:在热应激奶牛与正常奶牛血清中存在差异表达的miRNAs,某些重要的miRNA(如miR-181a)可能以独特的通路(如B细胞和T细胞受体信号通路)来调节奶牛热应激的发生过程。     

猪CD163 cDNA扩增及其稳定表达细胞系(CHO-K1)的建立

猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI将其插入到pcDNA3.1A质粒中,构建成真核表达载体。将表达载体转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出在细胞膜上稳定表达猪CD163的细胞系。结果显示,扩增出的猪CD163基因与基因库的序列基本一致,个别碱基的突变没有引起编码氨基酸的改变。通过转染表达载体和G418筛选,成功构建了稳定表达猪全长CD163基因的CHO-K1细胞系。经流式细胞仪检测证实,重组猪CD163可在CHO-K1细胞膜上进行表达,这为进一步研究PRRSV与CD163受体相互作用提供了必要条件。     

PRRSV细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体的制备

【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA,通过RT-PCR方法获得CD163SRCR5-SRCR6(第1 417~2 136bp,共720个bp)基因,将其克隆到pET-28a(+)载体上,构建重组表达载体pET-28a(+)-CD163,经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌,在BL21(DE3)中诱导重组目的蛋白表达,然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价,并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720bp的CD163SRCR5-SRCR6基因,成功构建了pET-28a(+)-CD163重组表达载体;SDS-PAGE结果表明,CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达;Western blot结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性,间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105;IFA试验结果显示,制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合,且在1∶20、1∶40倍稀释时,能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163SRCR5-SRCR 6重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体,其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。     

3种细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒的敏感性

为猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断及进一步研究提供参考,采用组织半数感染(TCID_(50))法和免疫荧光检测技术(IFA)研究Mac-145、PAM和CRL-2843-CD163细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的敏感性。结果表明:在Mac-145、PAM及CRL-2843-CD163细胞中,Mac-145细胞被HN07-1病毒感染最早,病毒增殖最快,荧光信号最强,TCID_(50)最大;PAM细胞其次;CRL-2843-CD163细胞最低。HN07-1病毒均能在Mac-145、PAM和CRL-2843-CD163细胞中增殖,且其对HN07-1病毒的敏感性依次为Mac-145PAMCRL-2843-CD163。     

PRRSV对猪树突细胞可溶性CD83释放影响的分析

为研究猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)感染是否促进猪树突细胞可溶性CD83(sCD83)的释放,在体外用PRRSV感染猪树突细胞,通过ELISA检测了树突细胞培养基sCD83的含量,结果显示PRRSV可明显提高猪树突细胞培养基sCD83的含量,表明PRRSV促进树突细胞sCD83的释放。为研究PRRSV对猪树突细胞CD83表达的影响,用RT-PCR和流式细胞术分别检测了细胞CD83mRNA的水平和细胞膜CD83的含量。结果显示PRRSV可提高猪树突细胞CD83 mRNA的水平,然而对细胞膜CD83的含量影响不大,说明PRRSV促进sCD83释放的作用高于刺激CD83表达的作用,致使膜结合的CD83保持较低的水平。PRRSV诱导树突细胞sCD83的释放为探讨PRRSV感染引起免疫抑制提供了重要的线索。     

CD163双等位基因编辑猪的制备及传代

【目的】猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）,俗称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种高致死性传染病,对世界养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV遗传变异性较大,因此国内外并未有理想疫苗能够对此病进行有效防制。Cluster of differentiation 163（CD163）是PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophage, PAM）的受体之一,研究旨在利用CRISPR/Cas9技术结合体细胞核移植技术制备CD163基因编辑的大白猪。【方法】针对猪CD163基因的第7外显子设计构建CRISPR/Cas9基因编辑载体;转染大白猪胎儿成纤维细胞,获得基因编辑阳性细胞克隆;以基因编辑细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎;胚胎移植到受体母猪生产CD163基因编辑猪,并进行后续的扩繁试验。【结果】设计的gRNA能够高效的识别靶位点。对获得的127个细胞单克隆进行PCR和测序显示,共有21个克隆发生突变,其中14个克隆为单等位基因突变或双等位基因杂合突变,7个克隆为双等位基因纯合突变。通过体细胞核移植技术,成功获得了CD163双等位基因编辑的纯合大白猪;并获得首批F₁代CD163基因编辑仔猪,目前健康状态良好。随后将有更多的F₁代CD163基因编辑猪陆续出生。【结论】制备的无抗性筛选标记的CD163双等位基因编辑猪,能够安全并快速地为培育抗PRRSV新品种猪提供育种材料。     

抗蓝耳病shRNA转基因表达载体的构建与功能验证

将靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24 h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.试验结果表明:所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.     

NMHC-ⅡA在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用

借用PRRSV结构蛋白GP5的抗独特型抗体Mab2-5G2,提取并纯化非肌肉肌球蛋白重链IIA(NMHC-ⅡA);通过激光共聚焦技术定位NMHC-ⅡA在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的分布;并采用免疫共沉淀技术研究其与PRRSV受体CD163的相互作用。结果表明:NMHC-ⅡA在Marc-145细胞内的表达量随着细胞被病毒感染时间的延长而增加,当PRRSV完全进入细胞后,NMHC-ⅡA的表达量有所降低;NMHC-ⅡA与PRRS病毒受体CD163存在相互作用,作用位点在M1(20—259 aa)和M3(714—1 040 aa)上。试验证明,NMHC-ⅡA在PRRSV感染过程中可能起协同作用。     

甘草酸与苦参碱组方体外抗PRRSV效果的研究

利用MTT法检测Marc-145细胞活力,通过药物对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染的阻断、增殖抑制和直接杀灭3个试验,探讨甘草酸与苦参碱不同组方抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的效果,并探讨最优组方对PRRSV的复制及TCID50的影响。结果显示,在增殖抑制和直接杀灭试验中各组方对PRRSV均有抑制作用,以苦参碱与甘草酸按质量比为1∶4,质量浓度为0.25 mg·m L-1时效果最好,在增殖抑制和直接杀灭试验的细胞病变抑制率分别是76.95%和83.25%,其治疗指数为12.696。最优组方药物能使病毒的TCID50下降,且与药物的质量浓度成正相关。     

CD163基因敲除大白猪的抗蓝耳病性能和主要生产性能研究

【目的】运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术获得CD163基因全敲除(CD163 gene knockout,CD163-KO)的克隆猪,验证该基因敲除大白猪的抗蓝耳病特性,并研究其与野生型大白猪在生理、生产和繁殖性能等方面的差别,评估CD163-KO大白猪的主要生产性能。【方法】用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株NADC30-like对本研究所获得的11头CD163-KO大白猪和5头年龄、体质量相当的野生型大白猪进行攻毒试验。连续14 d观察猪的临床症状,记录直肠温度变化,检测血清中PRRSV病毒含量和抗体水平。14 d后取肺部组织进行切片,通过PRRSV免疫荧光试验观察肺脏感染情况。采集CD163-KO和野生型大白猪肺泡巨噬细胞进行免疫染色,观察肺泡巨噬细胞表面CD163蛋白的表达情况;采集猪外周血单核细胞进行诱导分化,观察CD163-KO与野生型大白猪诱导分化的巨噬细胞对血红蛋白-结合珠蛋白复合物的摄取情况。最后,统计分析CD163-KO与野生型...     

甲基-CpG结合结构域蛋白2抑制PRRSV复制的研究

为了研究甲基-CpG结合结构域蛋白2 (MBD2)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的复制是否有抑制作用。首先,构建MBD2的3’-UTR报告质粒,通过双荧光素酶报告结果表明MBD2是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PRRSV感染MARC-145细胞,在24、36、48 h后分别取样,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blots试验进行检测。结果表明,PRRSV感染下调MBD2的mRNA和蛋白的表达水平。用真核表达载体pc DNA 3.1-Flag构建了MBD2的真核表达质粒pc DNA3. 1-Flag-MBD2,用pc DNA3. 1-Flag-MBD2转染MARC-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后收获细胞。TCID50的试验结果表明,过表达MBD2能降低PRRSV滴度,而qRTPCR和Western blots的结果则表明MBD2能降低PRRSV的载量;相反,MBD2的siRNA试验表明,下调表达有利于PRRSV在MARC-145细胞复制。通过基因缺失试验,构建MBD2部分结构域缺失的表达质粒,最终发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制起关键的作用。研究结果表明,MBD2是拮抗PRRSV的宿主内源性蛋白,并发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制中起关键的作用,而PRRSV可能利用miR-373来下调MBD2的表达,从而逃逸宿主对病毒的清除。     

猪乳外胞体总miRNAUnit对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制抑制的研究

通过对猪乳汁Exosome中总miRNA进行分离提取,以验证其对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抑制作用。首先提取猪乳汁中的Exosome,并将提取的Exosome对感染PRRSV的MARC-145细胞进行初步处理,于24、48 h后进行病毒滴度测定,并在MARC-145细胞上接种PRRSV病毒96 h后对细胞形态进行观察;随后对猪乳Exosome中的总miRNA进行进一步提取,用提取的总miRNA处理感染PRRSV的Marc-145细胞,于24、48 h后进行病毒滴度测定,同时也在MARC-145细胞上接种PRRSV病毒96 h后对细胞形态进行观察。结果表明,转染猪乳Exosome和转染猪乳Exosome总miRNA细胞中的PRRSV滴度都显著低于转染PBS(阴性对照);同时相对于阴性对照组,转染猪乳Exosome和转染猪乳Exosome总miRNA的细胞形态排列较紧密,边缘较清晰整齐。说明猪乳Exosome中存在与抑制PRRSV复制有密切关系的miRNA,本研究将为PRRS的预防和治疗提供新的理论依据和途径。     

重组猪α干扰素抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞增殖的初步研究

采用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)/Marc-145细胞体系验证重组猪α干扰素(rPolFN-α)制剂的抑制病毒作用.结果表明:rPolFN-α稀释至1010可有效预防PRRSV感染Marc-145细胞;当rPolFN-α稀释至1010可有效抑制病毒在Marc-145细胞上的增殖.研究结果在细胞水平上明确了rPoIFN-α对PRRSV的抑制作用,为进一步将rPoIFN-α应用于动物试验提供了参考.     

抗猪FcγRⅡb多抗阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体依赖增强作用研究

为验证猪FcγRⅡb在抗体依赖增强(ADE)作用中的功能,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清中提取IgG并制备F(ab′)2片段,将104 TCID50的PRRSV病毒与80μg/mL的F(ab′)2片段或抗PRRSV阳性血清(中和效价1/5.9,经128倍稀释)混合,共同感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞,发现亚中和滴度的阳性血清能显著增强病毒对PAM的感染,但不能增强病毒对Marc-145细胞的感染;而F(ab′)2片断不能增强病毒感染;用兔抗猪FcγRⅡb多抗孵育PAM细胞,再用上述病毒与阳性血清复合物感染PAM,结果阳性血清对病毒感染的增强作用受到明显抑制。表明猪FcγRⅡb能够介导PRRSV ADE作用。     

Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立

采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。