木薯MeP5CS和MeP5CR基因克隆及其干旱胁迫下的表达分析

在不同浓度(0、20%、30%、40%、50%)PEG处理下考察木薯(Manihot esculenta Crantz)叶片中脯氨酸含量的动态变化。从木薯中分别克隆了Me P5CS和Me P5CR基因,对其序列进行生物信息学分析,并分析了Me P5CS和Me P5CR基因在20%PEG胁迫处理下各组织中的表达。结果表明,脯氨酸含量受渗透胁迫快速诱导,在一定范围内随PEG浓度升高而明显升高,表现出较好的相关性。序列分析表明,Me P5CS基因c DNA全长2 217 bp,编码738个氨基酸,含有P5CS保守结构域;Me P5CR基因c DNA全长828 bp,编码275个氨基酸,含有P5CR保守结构域,它们分别与麻风树和蓖麻中的P5CS、P5CR亲缘关系较近。Me P5CS和Me P5CR基因在转录水平受到渗透胁迫的调控。     

玉米脱落酸受体ZmPYL9基因的克隆及功能探究

脱落酸(ABA)参与植物发育过程以及调控多种非生物胁迫的适应性,PYL基因作为ABA受体,直接影响ABA的生物合成。为了探究玉米中PYL家族基因的功能,克隆了一个ZmPYL9基因,该基因编码197个氨基酸;物种同源蛋白质系统进化分析发现,ZmPYL9与高粱同源蛋白相似度甚高,且具有相同的保守基序;启动子顺式作用元件分析发现,ZmPYL9基因ATG上游2 000 bp区域含有多种激素应答相关的结合位点;ZmPYL9基因组织表达分析结果表明,该基因属于组成型表达,在胚乳中高度表达。ZmPYL9基因正向响应外源ABA诱导,恢复正常培养后,该基因表达量急速下降且低于CK;但是ZmPYL9基因受PEG和PEG+ABA负向诱导,且在PEG+ABA胁迫下该基因表达量高于PEG胁迫下,恢复正常培养后,2种胁迫下该基因的表达量均表现上升趋势。说明ZmPYL9基因响应干旱胁迫和ABA诱导,且ABA可以提高干旱胁迫下该基因的表达量。     

木薯MeRbohE基因的克隆及表达分析

从木薯中克隆了1个Rboh基因—Me Rboh E,该基因全长5 397 bp,开放阅读框2 775 bp,编码925个氨基酸,编码的蛋白分子量为104.8 KDa,理论等电点为8.90,蛋白结构具有典型的植物Rboh基因家族特征。q RT-PCR结果表明,Me Rboh E基因在木薯组培苗的根中表达量最高,茎中次之,叶中最低;在受到低温(4℃)、高盐(300 mmol·L-1Na Cl)和100 mmol·L-1ABA诱导后,表达量呈现不同程度的上调,表明该基因能应答非生物胁迫。     

水分胁迫诱导的玉米叶片钙调素基因表达及其与ABA和H_2O_2的关系

以玉米(Zea mays L.)为材料,探讨了水分胁迫下玉米钙调素(CaM)基因CaM1、CaM2和CaM3在叶片中转录水平的变化;并对水分胁迫下脱落酸(ABA)积累和H2O2产生与CaM基因表达的关系进行了研究.结果表明,25% PEG 6000模拟的水分胁迫能够诱导上述玉米CaM基因在叶中的表达,其中对CaM1和CaM3的影响较为显著,3个基因具有各自不同的表达模式.外源ABA处理也能显著诱导这3个基因的表达,施用ABA合成抑制剂FLU明显抑制了水分胁迫下CaM基因表达,暗示水分胁迫下CaM基因表达增强依赖于ABA的积累.外源H2O2处理下3个CaM基因均出现2次表达增强的情况,ROS抑制剂或清除剂并不影响外源ABA诱导的CaM基因的前期表达,仅抑制了后期表达,暗示H2O2参与ABA诱导的CaM基因表达后期的调控,它们之间可能存在交谈机制,并且这种机制在不同CaM基因之间具有普遍性.     

水稻OsRZFP34基因逆境表达特征及其启动子的克隆与分析

采用qRT–PCR技术分析水稻OsRZFP34在高温(42 ℃)、低温(4 ℃)、10%聚乙二醇(PEG)6000模拟干旱、高盐(100 mmol/L NaCl)和脱落酸(ABA)处理(100 μmol/L)下的表达模式;克隆OsRZFP34基因启动子,并利用在线软件New PLACE和PlantCARE对其序列进行顺式作用元件分析;构建OsRZFP34pro::GUS表达载体并转化水稻;通过组织化学染色和GUS酶活性检测,分析在不同胁迫处理条件下OsRZFP34启动子驱动GUS基因表达的活性。qRT–PCR分析结果表明,上述5种处理均能不同程度地诱导OsRZFP34的表达,其中高温胁迫对其表达的诱导程度最强,而ABA对其表达只有微弱的诱导。顺式作用元件分析结果表明,该启动子上包含有多个与逆境响应、激素响应以及Ca2+信号转导相关元件。GUS组织化学染色和荧光分析结果显示,OsRZFP34基因启动子的活性受到高温、低温、PEG、盐和ABA的调控,表明该启动子是受多种逆境诱导的诱导型启动子。     

木薯MeASR3基因的克隆及表达分析

【目的】克隆木薯脱落酸、胁迫、成熟诱导蛋白(abscisic acid, stress, ripening-induced, ASR)的cDNA序列,检测该基因在ABA、H_2O_2、NaCl和甘露醇4种处理下的表达模式,为揭示ASR基因在木薯耐旱机制中的作用提供参考。【方法】以木薯KU50叶片总RNA反转录的cDNA为模板,利用PCR的方法扩增获得一个ASR家族基因,对其进行了氨基酸序列比对和进化树分析,并利用荧光定量PCR技术对该基因在多种处理下的表达模式进行分析。【结果】克隆得到的cDNA长度为459 bp,编码153个氨基酸,命名为MeASR3 (GeneBank登录号:XM_021744431.1)。序列比对结果表明MeASR3含有ASR家族蛋白的主要特征功能域,进化树显示MeASR3与橡胶树来源的ASR蛋白亲缘关系最近。荧光定量结果表明MeASR3在转录水平受到H_2O_2、甘露醇和高盐胁迫的诱导作用,同时受到ABA的抑制作用。【结论】克隆获得木薯MeASR3基因,该基因在转录水平响应ABA处理以及氧化、高盐和干旱胁迫,可能参与到ABA以及多种胁迫下的信号转导途径,可作为候选基因用于木薯耐旱机制的研究。     

不同光周期及不同胁迫对水稻OsHGO基因表达的影响

以水稻野生型日本晴为研究材料,采用不同光周期及不同胁迫对其进行处理,通过实时荧光定量PCR对三叶期的水稻叶片OsHGO基因的表达量进行检测。结果表明:OsHGO基因在长日照、短日照、全日照时的表达水平与对照相比差别不大,但黑暗处理可显著提高该基因的表达量。ABA(脱落酸)可诱导OsHGO基因的表达;SA(水杨酸)、MeJA(茉莉素)、低温胁迫、盐胁迫和稻瘟病菌下调OsHGO基因的表达。     

PEG和环己酰亚胺处理对花生叶片AhNCED1基因及蛋白表达的影响

采用Northern blotting和Western blotting方法分析了聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)和环己酰亚胺(Cycloheximide,CHX)处理对花生(Arachis hypogaea L.)叶片AhNCED1基因及蛋白表达变化的影响进行了研究,并运用酶联免疫吸附试验(ELISA)对不同胁迫处理后花生叶片内源脱落酸(Abscisic acid,ABA)的含量进行了测定.结果表明,质量分数30%的PEG处理引起四叶期花生叶片AhNCED1基因和蛋白表达量不断     

外源ABA对木薯叶片内源激素及淀粉合成相关基因的影响

在盆栽条件下,用外源脱落酸(Abscisic acid,ABA)处理块根形成期的木薯品种,测定处理及对照在不同时刻叶片中ABA等激素变化、ABA合成与失活以及淀粉合成途径关键基因的表达变化。结果表明:1)正常条件下木薯叶片内源ABA水平及ABA合成途径基因均存在明显的夜间低而白天较高的昼夜节律,ABA信号转导相关基因也表现出下午的高峰表达,它们与淀粉合成途径基因的夜间表达一般具有相反的趋势。2)ABA处理后,木薯叶片内源ABA含量迅速下降,与观察到的ABA合成途径基因表达下降与后期ABA失活基因激活表达相一致,同时发现细胞分裂素中的玉米素核苷(Zeatin riboside,ZR)和生长素(Indole acetic acid,IAA)水平发生改变,预示木薯具有迅速恢复ABA平衡态的机制,并且与其他类激素存在协同作用。3)与此同时,外源ABA处理明显抑制淀粉合成上游基因表达,特别是夜晚高峰期的表达,而对下游基因的抑制相对较小。说明这些基因及相关酶类不同程度受到ABA的调控;ABA明显倾向于调控淀粉合成上游相关基因;外源ABA处理改变了叶片临时淀粉合成速率。     

菊花Cm14-3-3υ基因的克隆及表达分析

[目的]本文旨在克隆菊花‘神马’Cm14-3-3υ基因,并初步分析其表达特征,为其功能研究奠定基础。[方法]从菊花‘优香’转录组库中获得编码拟南芥同源基因14-3-3υ序列信息,根据NCBI比对确定基因的cDNA全长并进行克隆,再利用生物信息学方法对该蛋白的功能和活性位点进行预测,同时利用实时定量PCR分析了在非生物胁迫条件下该基因的表达变化。[结果]Cm14-3-3υ的ORF序列长774 bp,编码257个氨基酸;亚细胞定位表明Cm14-3-3υ定位在细胞质和细胞核;生物信息学分析表明该蛋白有19个Ser、7个Thr和7个Tyr潜在的磷酸化位点,在N-端有5个蛋白结合区;表达模式分析显示,Cm14-3-3υ基因在根、茎、叶、花中均有表达,且受脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、盐和冷胁迫的诱导表达。[结论]本文克隆得到菊花Cm14-3-3υ基因,表达模式分析表明其受ABA、Me JA、盐和冷胁迫诱导表达。     

木薯ERF转录因子基因MeERF5克隆及表达分析

【目的】克隆木薯ERF转录因子基因MeERF5,并分析其在多种逆境胁迫下的表达模式,为深入研究MeERF5基因在木薯逆境胁迫应答中的调控机制提供参考。【方法】PCR扩增木薯品种华南8号的MeERF5基因编码区(CDS)全长序列,对其进行生物信息学分析,并利用根癌农杆菌介导法进行蛋白亚细胞定位。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MeERF5基因在木薯不同组织及多种逆境胁迫处理下的相对表达量。【结果】克隆获得MeERF5基因CDS序列为948 bp,与Phytozome数据库中的参考序列(登录号:Manes.01G085200.1)的核苷酸序列相似性为100.00%,其编码315个氨基酸残基,蛋白分子量为77.84 kD,理论等电点(pI)为5.08,属于酸性蛋白,其二级结构中α-螺旋占16.51%,β-转角占3.81%,无规则卷曲占62.22%,延伸链占17.46%,亚细胞定位于细胞质。通过多序列比对及系统进化分析发现,MeERF5蛋白含有1个AP2/ERF保守结构域,与同属大戟科的橡胶树ERF蛋白氨基酸序列相似性最高(76.8%),亲缘关系最近。MeERF5基因在木薯不同组织中均有表达,其中,在茎中的相对表达量最高,在腋芽中的相对表达量最低。MeERF5基因能快速响应低温胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫、盐胁迫及ABA处理,均出现诱导表达上调的现象,其中,在氧化胁迫下,MeERF5基因的相对表达量持续上升;在干旱胁迫、盐胁迫及ABA处理下,MeERF5基因的表达量先上升后降低;在低温胁迫下,MeERF5基因在处理5 h时的相对表达量达到最大值,之后有所下降,但在处理48 h时再度上升。【结论】克隆获得的MeERF5基因属于AP2/ERF类转录因子,参与木薯多种非生物胁迫应答过程。     

玉米1- 吡咯啉-５- 羧酸合成酶

脯氨酸在植物渗透调节中起举足轻重的作用,1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸的谷氨酸合成途径中的关键酶,为了研究玉米P5CS基因家族与玉米抗逆性的关系,对玉米幼苗进行了非生物胁迫(干旱、低温、盐胁迫)处理,利用半定量RT-PCR技术分析了ZMP5CS基因家族在不同胁迫条件下的表达特性.结果表明,ZMP5CS基因家族中除ZM02G27230以外的基因不论地上部叶还是地下部根均被干旱胁迫诱导上调表达,但各成员之间其表达量最高点出现的时间不同;相同处理同一基因相同的处理时间点地上部与地下部基因表达量存在差异,在干旱胁迫下ZM08G14210的表达量最高,在盐胁迫下ZM08G31890的表达量最高,在低温胁迫下ZM06G25580的表达量最高,说明ZMP5CS基因家族表达受非生物胁迫的诱导.     

玉米1-吡咯啉-5-羧酸合成酶在非生物胁迫下的表达分析

脯氨酸在植物渗透调节中起举足轻重的作用,1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸的谷氨酸合成途径中的关键酶,为了研究玉米P5CS基因家族与玉米抗逆性的关系,对玉米幼苗进行了非生物胁迫(干旱、低温、盐胁迫)处理,利用半定量RT-PCR技术分析了ZMP5CS基因家族在不同胁迫条件下的表达特性。结果表明,ZMP5CS基因家族中除ZM02G27230以外的基因不论地上部叶还是地下部根均被干旱胁迫诱导上调表达,但各成员之间其表达量最高点出现的时间不同;相同处理同一基因相同的处理时间点地上部与地下部基因表达量存在差异,在干旱胁迫下ZM08G14210的表达量最高,在盐胁迫下ZM08G31890的表达量最高,在低温胁迫下ZM06G25580的表达量最高,说明ZMP5CS基因家族表达受非生物胁迫的诱导。     

H2O2和ABA对干旱高温复合胁迫诱导的玉米叶片抗氧化防护基因表达的影响

为确定H2O2和脱落酸(ABA)对干旱高温复合胁迫诱导的苗期玉米(Zea mays L.)叶片抗氧化防护系统的影响,利用玉米ABA缺失突变体vp5及其野生型Vp5为试验材料,在不同胁迫下使用H2O2清除剂KI,ABA抑制剂钨酸钠(T)预处理后,测定了体内4个抗氧化防护基因SOD4,GR1,CAT1和cAPX的表达.结果...     

木薯海藻糖-6-磷酸酯酶MeTPP6基因克隆及其表达分析

海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)负责海藻糖生物合成催化反应的最后一步,是植物海藻糖生物合成途径的关键酶。采用RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆了1个TPP基因,命名为MeTPP6,该基因含有1个1 122 bp的开放阅读框,编码373个氨基酸,具有TPP家族保守结构域。系统进化树分析表明,MeTPP6与杞柳和杨树中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性高达89.7%和89.0%。启动子分析表明,MeTPP6含有干旱、低温、热胁迫、激素(如ABA)和光响应等相关元件。荧光定量PCR分析表明,MeTPP6在叶片和叶柄中表达量最低;在须根和储藏根中表达量最高,分别为叶片表达量的4.2倍和4.5倍。而且,MeTPP6基因的表达能被干旱、低温和ABA处理显著诱导。这些结果表明,MeTPP6通过依赖于ABA的信号通路在转录水平参与木薯干旱和低温胁迫,可作为重要候选基因进一步研究其在木薯非生物逆境中的功能。     

棉花GhNCED2基因表达载体构建及转基因烟草表达分析

[目的]9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是高等植物脱落酸(ABA)生物合成途径中的关键限速酶.为了进一步研究GhNCED2基因的功能.[方法]构建该基因植物超表达载体PZP35S - GhNCED2,通过农杆菌介导法转入野生烟草,并利用卡那霉素筛选、PCR扩增验证和RT - PCR表达分析.对转基因烟草T1代分别进行2; NaCl、4℃、20; PEG逆境胁迫处理,利用实时荧光定量RT-PCR分析表明.[结果](1)GhNCED2基因已整合入烟草基因组中,并能在T1代中稳定表达.(2)随着时间的推移其表达量变化规律基本一致呈现先上升后下降的趋势,2; NaCl、20; PEG胁迫后GhNCED2基因相对表达量到达峰值的时间稍落后于4℃胁迫,20; PEG处理后基因的相对表达量要高于其他处理.[结论]干旱、盐碱及低温胁迫均都能诱导GhNCED2基因的大量表达,且该基因对干旱胁迫的响应更加积极,而对冷害更加迅速.     

水曲柳FmPAL基因的克隆及表达模式的分析

在催化苯丙烷类代谢途径的第一步反应中,苯丙氨酸解氨酶(PAL)起到关键酶和限速酶的作用,对植物有非常重要的生理意义。对水曲柳FmPAL基因进行了生物信息学以及表达模式分析,包括时空及其在NaCl、低温、IAA、ABA以及GA3处理下的特异性表达特征。结果表明,水曲柳FmPAL编码区全长为1674bp,编码557个氨基酸。FmPAL蛋白为稳定的亲水性蛋白,不存在信号肽但具有跨膜结构域。FmPAL基因与樟子松的PAL遗传距离比较近,说明它们亲缘关系比较近。FmPAL基因在新生枝和叶中相对表达量高于花、芽、叶柄等部位,并在新生枝中表达量最高,具有组织特异性。水曲柳新生枝和叶片中FmPAL基因在5月表达量相对较高。在非生物胁迫和激素诱导下,FmPAL基因的表达量随处理时间而改变,但其变化趋势不尽相同。在低温(4℃)、盐(NaCl)2种非生物胁迫下,FmPAL基因在处理12h后表达量最高,分别为对照组的34.3、24.3倍;在低温(4℃)和盐(NaCl)处理处理1h后,FmPAL基因表达量最低。FmPAL基因在脱落酸(ABA)处理1h后表达量最高,为对照组的11.9倍;生长素(IAA)处理12h后表达量最高,为对照组的37.2倍;赤霉素(GA)处理24h后表达量最高,为对照组的21.5倍;而FmPAL基因在脱落酸(ABA)、生长素(IAA)和赤霉素(GA)处理3h后表达量皆为最低。研究结果表明FmPAL基因响应非生物胁迫以及植物激素信号诱导。     

脯氨酸代谢途径在调控水稻phyB突变体干旱胁迫耐性中的作用

本研究分析了水稻野生型和phyB突变体中脯氨酸代谢途径关键基因的表达水平。结果显示,干旱处理能够诱导脯氨酸生物合成相关基因OsP5CS1和OsOAT的表达,抑制脯氨酸生物降解基因OsP5CDH的表达。且phyB突变体中OsP5CS1基因的表达水平明显高于野生型,据此推测phyB负调控OsP5CS1基因的表达。为了分析OsP5CS1基因的高水平表达是否与phyB突变体较强的干旱胁迫耐性有关,本研究进一步培育了转OsP5CS1基因烟草。离体叶片失水速率结果表明,转基因烟草的失水速率小于野生型;盐胁迫条件下,转基因烟草的分化率明显高于野生型。综上所述,phyB对脯氨酸代谢途径的调控是phyB突变体具有较强干旱胁迫耐性的重要因素之一。     

木薯MeHSF7基因克隆及表达分析

[目的]克隆木薯热激转录因子(HSF)基因MeHSF7并分析其在抗逆响应和采后生理性变质(PPD)过程中的表达情况,为研究MeHSF7基因在响应干旱胁迫及延缓生理性变质的调控机制提供理论参考.[方法]通过同源克隆从木薯叶片克隆MeHSF7基因,对其生物信息学和组织表达特性进行分析,并明确其在干旱和脱落酸(ABA)处理下及PPD过程中的表达模式.[结果]克隆获得的MeHSF7基因开放阅读框(ORF)为1206 bp,编码401个氨基酸残基,与参考序列(Manes.02G087400.1)仅存在2个碱基差异,位于第2染色体上,含有1个内含子和2个外显子.MeHSF7蛋白理论分子量46.1 kD,理论等电点(pI)5.95,为不稳定蛋白,定位于细胞核,无跨膜区域,含有HSF蛋白的保守结构域DBD(DNA结合功能域)、HR-A Core和HR-B Core,属于HSFA亚家族,与橡胶树和麻疯树HSF蛋白的氨基酸序列同源性最高,分别为79.20%和64.95%,在系统发育进化树上与橡胶树HSF蛋白聚在同一小分支,表明二者亲缘关系较近.MeHSF7基因在不同组织中的表达量均较低,但不同组织间存在明显差异,在松散性胚性愈伤组织、分化胚组织、须根和根顶端分生组织中的表达量相对较高,在叶柄中的表达水平最低.MeHSF7基因启动子区域含有ABA响应元件(ABRE)、干旱诱导元件(MBS)和光响应元件(ACE、Box 4)等.干旱处理下,MeHSF7基因表达量随处理时间的增加整体上呈升高趋势,在处理7 d后达峰值;在ABA处理下,处理5和7 d后MeHSF7基因表达量较处理0和3 d后明显上调,尤其在处理5 d后达峰值,表明MeHSF7基因表达受干旱和ABA处理的诱导.在木薯块根的PPD过程中,MeHSF7基因表达量随暗培养时间的增加而升高,处理6、12和48 h的表达量分别是处理0 h的2.1、2.2和3.2倍.[结论]MeHSF7基因可能在转录水平通过依赖于ABA信号通路的途径响应干旱胁迫及木薯块根的氧化胁迫,可作为候选基因用于研究其在木薯抗逆和采后储存中的调控功能.     

不结球白菜病程相关蛋白基因BcPR5的克隆及表达分析

[目的]本文旨在研究不结球白菜病程相关蛋白基因Bc PR5的结构与表达特征。[方法]通过RACE技术,从抗病品种‘苏州青’叶片克隆到Bc PR5基因的全长c DNA序列。采用RT-q PCR方法分析该基因在霜霉病菌诱导,水杨酸(SA)、茉莉酸(Me J)和脱落酸(ABA)等激素处理条件下的表达模式。SDS-PAGE技术分析该基因的原核表达特征。[结果]Bc PR5基因的c DNA全长为954 bp,其中开放阅读框长度为732 bp,共编码243个氨基酸,相对分子质量为26.1×103,理论等电点是9.3。氨基酸同源系统进化分析表明,不结球白菜Bc PR5基因与同属植物的进化关系相近,其中与大白菜第6号染色体上的基因同源性最高(100%)。RT-q PCR分析表明,抗病品种‘苏州青’和感病品种‘矮脚黄’在霜霉病菌和非生物胁迫(SA、Me J和ABA)诱导过程中,Bc PR5基因的表达量均呈先升高后降低的趋势,且抗病品种高于感病品种。原核表达结果表明,该蛋白在终浓度为1.0 mmol·L-1的IPTG诱导4 h后能实现融合蛋白的高效表达。[结论]Bc PR5在不结球白菜抗霜霉病防御反应中发挥着重要作用,研究结果为该基因的功能验证提供理论基础。