越桔 ISSR-PCR 反应体系建立与优化

以改良CTAB法提取越桔(Vaccinium Linn.)品种薄雾DNA为材料,采用正交设计L16(45)表探讨了Tag酶;Mg~(2+);DNA;dntps及引物浓度5个主要因素对越桔ISSR-PCR扩增反应的影响,通过直观分析和方差分析结合,建立了越桔ISSR-PCR(20μL)最佳反应体系,各组分的浓度为:Tag酶0.75 U,Mg~(2+)1.875 mmol/L,DNA 0.8mmol/L,dntp 0.1mmol/L,引物0.2μmol/L.在此基础上探讨了引物UBC835的最佳退火温度、循环次数和延伸时间,结果分别为54.2℃、35次、60s.选用两个引物对21份越桔资源进行ISSR扩增,结果显示优化的体系稳定性较高.     

野牛草ISSR-PCR反应体系的优化与建立

根据正交试验设计原理探索野牛草[Buchloe dactyloides(Nutt.)Engelm.]ISSR-PCR反应体系中各主要成分的最优化用量,对影响野牛草ISSR-PCR反应体系的主要因素[d NTP、Taq DNA聚合酶、引物(Primers)、Mg~(2+)的用量]进行优化,获得野牛草的ISSR-PCR最适反应体系为20μL的反应体系,包括引物(2.0μmol/L)4.0μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2μL、MgCl_2(25 mmol/L)1.6μL、d NTP(2 mmol/L)2.0μL和模板DNA(20 ng/μL)3.0μL。该优化体系的建立为利用ISSR分子标记进行野牛草种质资源遗传多样性研究、种质资源鉴定等奠定了基础。     

虎杖ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用SDS法和CTAB法提取虎杖的DNA,并比较两种方法的效果,通过单因子试验优化影响虎杖ISSR-PCR的主要参数.结果表明,CTAB法提取的虎杖总DNA质量优于SDS法.虎杖ISSR-PCR的最佳反应体系总体积为25 μL,1×PCR reaction buffer[10 mmol Tris-HCl(pH8.3),50 mmol KCl],40 ng模板DNA,0.25 mmol·L-1 dNTPs,2U Taq DNA聚合酶,2.0 mmol·L-1 MgCl2,1.0 μmol·L-1引物.该反应体系适用于应用ISSR标记开展虎杖DNA指纹、遗传多样性等研究.     

冬虫夏草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步研究冬虫夏草的遗传多样性,试验采用改良的CTAB法提取高质量DNA模板,克服了冬虫夏草中富含多糖、蛋白、盐类和色素的影响。建立并优化了冬虫夏草ISSR-PCR最适反应体系,即在25μL体系中反应物的含量分别为:10×PCRBuffer 2.5μL,模板DNA20 ng,引物0.9μmol/L,dNTP 0.12 mmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.5 U,引物835号的最适退火温度为50.8℃。结果表明此反应体系标记位点清晰、稳定、重复性好。     

菊芋ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用正交试验设计的方法,从Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度4因素对菊芋ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度及退火温度进行梯度检测。结果表明:菊芋20μl最佳反应体系包括10×PCR buffer,200μmol/L dNTP,0.5μmol/L引物,1.5 mmol/L Mg2+,1.0 U Taq DNA聚合酶和50 ng模板DNA。这一优化系统的建立,将为菊芋种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。     

金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以金银花叶片基因组DNA为模板,通过单因素试验,研究了退火温度、Taq DNA聚合酶的用量及模板DNA、引物、dNZPs、Mg2 浓度等6种因素对ISSR-PCR扩增的影响,建立了适合于金银花IS-SR-PCR反应体系和扩增程序,即在20μ1反应体系中,内合1×PCR反应缓冲液(Mg2 free)、1.5U TaqDNA聚合酶、0.15mmol/L dNTPs、0.41xmo1/L 引物、1.5mmo1/L MgC12、60ng模板DNA.确定了适宜的退火温度为49.9℃.扩增程序为94℃预变性5min;35个循环为94℃变性30s,49.9℃退火30s,72℃延伸1.5min;最后72℃延伸7min,4℃保存.利用优化反应体系,从100务ISSR引物中筛选出10条稳定性和重复性高的引物;以这1O条引物对22个金银花品种基因组DNA扩增,共扩增出108条带,其中多态性条带96条.多态性条带比率为88.9%.金银花ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定了良好基础.     

金荞麦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为金荞麦品种ISSR指纹图谱建立、新品种选育、数量性状基因定位等工作提供科学依据,以金荞麦为材料,通过单因素试验和正交试验对影响ISSR-PCR反应体系的主要成分进行了优化,建立了稳定、可重复的金荞麦ISSR-PCR扩增反应体系。在20μL的反应体系中10×PCR buffer(不含Mg2+)2.0μL,2U Taq DNA聚合酶0.1μL,0.25mmol/L dNTPs 2.5μL,20ng/μL基因组DNA 1.0μL,2.5mmol/L Mg2+1.2μL,100μmol/L引物0.6μL,去离子水12.6μL。     

蛇莓ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用单因素试验对蛇莓ISSR—PCR反应体系中的6种主要反应因子（模板DNA、Mg^2＋、Taq DNA聚合酶、BSA、dNTP及引物）进行优化筛选，确立了适合蛇莓ISSR分析的最佳PCR扩增反应体系，即10μl PCR反应体积中含：1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液（10mmol／L Tris·HCl，pH值9．0；50mmol／L KCl；0．1％Triton X-100），1．75mmol／L Mg^2＋，2mg／ml BSA，0．2mmoL／L 4×dNTP，10ng模板DNA，18pmol引物，0．5U Taq DNA聚合酶。     

桑叶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立和优化桑叶稳定的ISSR-PCR反应体系和扩增程序。[方法]采用5因素4水平的正交试验和单因子梯度优化相结合的方法对最适因素水平进行筛选。[结果]适用于桑叶的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为:dNTPs 0.35 mmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、Taq酶1.25 U、引物0.4μmol/L、DNA 100 ng。[结论]对于桑叶ISSR-PCR试验,一次正交试验基本可以建立满足要求的ISSR-PCR体系。     

女贞ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用单因子试验,测试了女贞ISSR-PCR反应体系中的主要影响因子。经过优化实验,建立了一套适合于女贞的稳定的ISSR-PCR反应体系:10×buffer2.5μL,2.0mmol·L-1的MgCl2,200μmol·L-1的dNTPs,1.5U的Taq酶,0.4的μmol·L-1的引物,10ng的DNA模板。PCR扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性40s,52～62℃退火45s,72℃延伸120s,进行35个循环,72℃延伸8min,4℃保存。应用该优化的ISSR-PCR实验体系对12份女贞种质材料进行了扩增,均能扩增出丰富稳定的条带。     

台兰 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化

[目的]建立台兰稳定可靠的ISSR-PCR分子标记反应体系。[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA,并对影响台兰ISSR-PCR反应体系的主要成分进行筛选和优化。[结果]台兰的ISSR-PCR优化反应体系为:25μl PCR反应体积中,2.5μl 10×PCR buffer,2.0 mmol/L MgCl2,100 ng模板DNA,0.5 mmol/L dNTPs,0.22 U Taq DNA聚合酶,0.4μmol/L引物,15.78μl双蒸水。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行40个循环:94℃变性30 s,复性温度根据各引物的TM值略低1~2℃,30 s,72℃延伸50 s,循环结束后72℃延伸7 min。[结论]台兰ISSR-PCR优化反应体系为今后利用ISSR技术进行台兰种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

桑树ISSR-PCR反应体系建立及优化

采用正交试验设计L₁₆(4⁵)对桑树ISSR-PCR反应体系中的模板DNA、引物、Mg²⁺、dNTPs和rTaq酶5个因素及反应程序中变性时间、退火时间、延伸时间和循环数进行优化分析。结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为DNA模板>rTaq酶>Mg²⁺>引物>dNTPs。最终确立了最佳反应体系,即在10μL反应体系中,含25 ng/μL DNA模板1μL、10×PCR buffer 1μL、20μmol/L引物0.2μL、2.5 mmol/L Mg²⁺ 0.8μL、2.5 mmol/L dNTPs 1μL、5 U/μL rTaq 0.1μL。优化得到的反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性40 s,合适的退火温度退火45 s,72℃延伸90 s,40个循环;72℃延伸10 min,16℃保存。通过梯度PCR,确定引物ID37的退火温度为49.5℃。稳定性检测表明该体系能用于桑树ISSR分析。     

三七ISSR-PCR反应体系建立及优化

 为建立和优化三七 ISSR PCR反应体系,运用正交试验和单因子试验分析模板DNA,TaqDNA聚合酶、引物、Mg2+和dNTPs 5个因子对ISSR PCR反应影响。结果发现,三七 ISSR PCR 25μL反应体系中5个因子最佳水平：DNA模板为9.6ng,TaqDNA聚合酶为2.0u, Primer浓度为1.0mmol/L,dNTPs浓度为0.68mmol/L,Mg2+浓度为2.8mmol/L。研究结果为利用ISSR分子标记技术研究三七提供了理论支持。     

田野菟丝子ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用ISSR技术对田野菟丝子的遗传多样性进行了研究,通过筛选引物并对影响PCR扩增效果的一些因素如Mg2 浓度、牛血清白蛋白浓度、4×dNTP浓度、模板DNA用量、引物用量、TaqDNA聚合酶用量以及退火温度等指标进行优化,建立了可用于田野菟丝子ISSR分析最适宜的反应体系:10μl PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris.HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,2.0mg/ml牛血清白蛋白,0.2 mmol/L4×dNTP,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 UTaqDNA聚合酶。引物UBC811的最适退火温度为50.7℃。     

大花君子兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以大花君子兰为材料研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对君子兰ISSR扩增结果的影响,并对影响PCR反应体系的主要成分及退火温度进行筛选和优化,确立了适合君子兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Mg2+为2.0 mmol/L,模板DNA用量为50 ng/μL,Taq酶0.4 U,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,引物浓度为0.4 mmol/L。筛选出了13个适宜君子兰遗传分析的ISSR引物,确定最适宜退火温度为52~56℃。     

老芒麦ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]建立并优化老芒麦ISSR-PCR反应体系和扩增程序,以期为探讨老芒麦种质资源的遗传多样性提供科学依据。[方法]采用正交设计试验和单因素试验相结合的方法对老芒麦的ISSR-PCR的反应体系进行构建和优化,对影响ISSR-PCR扩增效果的Taq酶、模板DNA的浓度、Mg2+、dNTP和引物浓度等因素进行优化,同时对退火温度、循环次数和延伸时间进行筛选。[结果]在25μl体系中各反应物的最适含量为:0.2 mmol/L dNTP,0.2μmol/L ISSR引物,1.50 U Taq DNA聚合酶,2.5μl 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl2和40 ng模板DNA;循环次数和延伸时间分别是35次和90 s。[结论]该研究建立并优化了老芒麦ISSR-PCR反应体系,通过2份老芒麦种质对所优化体系得验证,结果显示体系稳定,可用于老芒麦种质资源遗传分析。     

青海云杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]确定适应青海云杉ISSR-PCR反应的最佳反应体系。[方法]以青海云杉（Picea crassifolia kom.）为材料,对影响其ISSR—PCR扩增结果的各因素（Mg^2＋、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、引物、退火温度）进行筛选和优化。[结果]青海云杉ISSR—PCR最佳反应体系为在20山反应体系中包含1μl 10×buffer,1．5mmol／L的Mg^2＋ 0．2mmol／L的dNTPs,TaqDNA聚合酶1．0U,模板DNA 40ng,引物0．6μmol／L。对青海云杉ISSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验发现,引物UBC818的最适退火温度为54．2℃,且最适退火温度因引物而异。[结论]该优化ISSR．PCR反应体系的建立,为今后利用ISSR技术进行青海云杉种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

宁夏枸杞ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验和单因子梯度优化相结合的方法,建立和优化枸杞稳定的ISSR - PCR的反应体系和扩增程序.结果表明,适用于枸杞的25 μL ISSR - PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为:dNTPs 0.25 mmol/L,Mg2+2.0 mmol/L,引物0.4μmol/L,模板DNA 50 ng,Taq酶1.0U.对于枸杞ISSR - PCR试验,一次正交试验完全可以建立满足要求的PCR体系.     

高加索三叶草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

高加索三叶草(Trifolium ambiguum Bieb.)是许多干旱和寒冷地区可以种植并在各方面表现优良的三叶草种,建立适用于高加索三叶草的ISSR反应体系,将为ISSR标记技术在三叶草属品种资源研究中的应用提供参考.本试验通过优化影响高加索三叶草ISSR-PCR的主要参数,建立适于高加索三叶草的ISSR反应体系和扩增程序.在25μL体系中各反应物的最适含量为:20 ng模板DNA,0.2 mmol/L dNTP,0.8μmol/L ISSR引物,1.0 U TaqDNA聚合酶,2.5μL 10×PCR Buffer,2.0mmol/L MgC12.PCR扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸1 min,共30个循环;72℃延伸7min,4℃保温.     

平果金花茶ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交设计和单因素试验相结合的方法,快速建立并优化平果金花茶ISSR-PCR反应体系和程序。平果金花茶ISSR-PCR适宜的反应体系:20μL反应体系含模板DNA 50ng、引物0.75μmol/L、dNTP 0.15 mmol/L、Mg2+1.50 mmol/L、TaqDNA聚合酶1.00 U、10×buffer 2.00μL。扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,52.2℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,45个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。经过8份平果金花茶种质的检测,表明该体系稳定、重复性好,可用于平果金花茶遗传多样性分析。