猪肺泡巨噬细胞的分离、纯化和冷冻保存研究

通过冷PBS气管灌洗法分离猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM),优化了PAM的纯化和冷冻保存方法,并进行了PAM纯度鉴定、细胞吞噬功能和存活率检测.结果表明:RPMI-1640培养液比DMEM培养液更适于PAM的培养和冷冻保存;巨噬细胞抗体MAC387免疫荧光检测表明,贴壁2h后更换培养液获得的PAM纯度最高(P＜0.05);用70％ RPMI-1640+20％新生牛血清+10％ DMSO的体系冷冻保存细胞密度为1×107个/mL的PAM可获得高达98.09％的存活率,冻存前后PAM的墨汁吞噬率无显著差异(P＞0.05).     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒样品对细胞的敏感性

从疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的发病猪场采集组织和血清样品并按病料分成2组,通过反转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测样品中高致病性PRRSV发生变异的Nsp2部分基因,初步筛选出PRRSV阳性样品后分别通过Marc-145和PAM细胞分离培养。结果表明：从45份阳性病料中成功分离到29份高致病性PRRSV,其中从血清样品中成功分离的约占总数72.5%,从组织样品中成功分离的约占总数27.5%;通过Marc-145细胞分离获得的病毒有19份,通过PAM细胞分离获得的有24份,其中有14份是Marc-145和PAM共同分离得到。试验获得的血清是高致病PRRSV分离的理想样品,该病毒对Marc-145和PAM细胞的敏感性差异不显著。     

鸡小肠上皮细胞表面大豆凝集素受体的标记

以0日龄海蓝褐蛋鸡为材料,用胶原酶结合组织块培养的方法分离培养了鸡小肠上皮细胞,通过抗角蛋白单克隆抗体对分离的细胞进行纯度鉴定,并用荧光标记大豆凝集素对已鉴定的细胞大豆凝集素结合位点进行了标记.结果表明:试验获得了鸡小肠上皮细胞原代培养物纯度＞90%,可用于后续试验,荧光标记表明细胞表面存在大量的大豆凝集素受体.     

3种壳聚糖对团头鲂体外头肾吞噬细胞呼吸爆发功能的影响

采用51%Percoll非连续密度梯度离心法分离团头鲂头肾吞噬细胞,在光镜和电镜下观察所分离细胞的显微、超微结构及吞噬作用;以二氢罗丹明(DHR123)为荧光探针,流式细胞仪检测细胞在佛波豆蔻酸乙酯(PMA)刺激下产生的呼吸爆发活动;光镜下观察壳聚糖对吞噬细胞吞噬功能的影响。结果表明:分离得到的细胞具有吞噬细胞(巨噬细胞与中性粒细胞)的形态学及功能特征;3种壳聚糖组(100μg/mL)均能提高吞噬细胞的呼吸爆发功能,在发荧光细胞比例及细胞发荧光强度上均极显著高于对照组。其中水溶性壳聚糖组的发荧光细胞比例显著高于其他试验组,而在细胞发荧光强度上,普通壳聚糖作用相对较高;同时壳寡糖能增强吞噬细胞的吞噬活性。     

4种方法制备外周血淋巴细胞总RNA对鹅α干扰素的影响比较

无菌采取鹅外周血并进行抗凝处理,以全血提取法、细胞分离直接提取法、细胞分离培养提取法及细胞分离诱导提取法分别提取外周血中淋巴细胞的总RNA;紫外分光光度计检测总RNA的纯度和得率;以总RNA为模板通过RT-PCR法扩增鹅α-干扰素(Go IFN-α)基因,并构建重组质粒p GEMT-α,通过比较Go IFN-α序列确定各种提取方法的可行性。结果显示,4种方法提取的RNA纯度高,均可作为模板扩增出目的基因,满足后续的分子生物学研究;其中以细胞分离直接提取法制备的RNA产量最多,此结论为外周血淋巴细胞总RNA的提取提供了一种更快捷的方法。     

犊牛睾丸支持细胞的原代培养与鉴定

寻求简便经济的方法分离纯化犊牛睾丸支持细胞,通过不同的方法对支持细胞进行鉴定。采用胶原酶和胰蛋白酶次第消化分离犊牛睾丸支持细胞,5 h后换液,24 h后用Tris-HCl处理除去精原细胞,实现进一步纯化。用Feulgen染色法鉴定支持细胞,用SABC染色法检测支持细胞上Fas-L的表达。结果培养的支持细胞纯度达到90%以上。Feulgen染色后明显可见支持细胞核内的双极小体。SABC染色法检测支持细胞为阳性。建立了培养犊牛睾丸支持细胞的方法,Feulgen染色和Fas-L检测是鉴定支持细胞的有效方法。     

PCV2感染对猪肺泡巨噬细胞Fc受体数量和吞噬功能的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康普通仔猪,在接种后不同时间宰杀,收集肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照组。用EA花环试验测定Fc受体数目,用吞噬鸡红细胞试验测定吞噬功能,来分析PCV2感染对PAM某些生物学活性的影响。结果显示,PAM表面Fc受体数和吞噬鸡红细胞数的变化规律一致,与对照组相比,两者数量在接种后3 d时下降至最低,之后回升,14 d时基本恢复正常。本研究表明,PCV2感染可引起PAM吞噬和清除病原的能力出现短暂下降。     

兔血管内皮细胞的体外培养及生物学特性

为研究兔瘟病毒对兔血管内皮细胞的致病性,建立兔血管内皮细胞的体外培养方法.采用消化法和组织块贴壁法分离获得兔子血管内皮细胞,对其进行体外培养,并对细胞进行第Ⅷ因子相关抗原的免疫组织化学鉴定和CD34的间接免疫荧光检测.结果表明,消化法分离的细胞20 h左右贴壁,约1周长成单层,纯度较高;组织块贴壁法分离的细胞两周才开始...     

桔梗皂苷D对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞免疫功能的影响

【目的】探讨桔梗皂苷D对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞免疫功能的影响。【方法】无菌分离小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞,制备淋巴细胞和巨噬细胞悬液。分别培养这2类细胞,并分为空白对照组、阳性对照组（左旋咪唑处理细胞）及25,50,75 和100 μg/mL桔梗皂苷D组,采用MTT法检测桔梗皂苷D对淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬功能的影响,采用ELISA法检测桔梗皂苷D对淋巴细胞IL-2、IL-4和巨噬细胞TNF-α、IL-12分泌的影响。【结果】桔梗皂苷D能够促进淋巴细胞增殖,增强巨噬细胞的吞噬功能,并可刺激淋巴细胞IL-2、IL-4和巨噬细胞TNF-α、IL-12的分泌,其中以50 μg/mL组效果最佳。【结论】桔梗皂苷D能增强小鼠淋巴细胞和巨噬细胞的免疫调节活性。     

桔梗皂苷D对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞免疫功能的影响

【目的】探讨桔梗皂苷D对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞免疫功能的影响。【方法】无菌分离小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞,制备淋巴细胞和巨噬细胞悬液。分别培养这2类细胞,并分为空白对照组、阳性对照组(左旋咪唑处理细胞)及25,50,75和100μg/mL桔梗皂苷D组,采用MTT法检测桔梗皂苷D对淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬功能的影响,采用ELISA法检测桔梗皂苷D对淋巴细胞IL-2、IL-4和巨噬细胞TNF-α、IL-12分泌的影响。【结果】桔梗皂苷D能够促进淋巴细胞增殖,增强巨噬细胞的吞噬功能,并可刺激淋巴细胞IL-2、IL-4和巨噬细胞TNF-α、IL-12的分泌,其中以50μg/mL组效果最佳。【结论】桔梗皂苷D能增强小鼠淋巴细胞和巨噬细胞的免疫调节活性。     

改进原位循环灌流法分离小鼠肝细胞研究

【目的】建立小鼠肝细胞分离原位循环灌流方法,为肝脏细胞蛋白质组研究提供技术技持。【方法】参考Seglen胶原酶两步原位灌流法,对其进行改进,建立原位循环灌流分离小鼠肝细胞方法,对小鼠肝脏进行原位循环灌流,离体消化肝脏组织,差速离心获得纯化小鼠肝细胞;台盼蓝拒染试验检测肝细胞活性,常规血球计数法计算肝细胞得率;利用显微形态观察、HE、PAS及免疫细胞化学等检测方法鉴定所获得的肝细胞纯度;用含体积分数20%FBS的RPMI-1640细胞营养液对原代小鼠肝细胞进行培养。【结果】建立了原位循环灌流分离小鼠肝细胞的方法,采用该方法可从每只小鼠肝脏中成功分选到细胞活性大于90%、纯度在95%以上的(4.2×107)～(6.5×107)个肝细胞。原代分离的小鼠肝细胞培养4h后,大多数细胞可贴壁,12h后贴壁完全,细胞呈伸张状态,该原代肝细胞可持续培养7d以上,且细胞形态状况良好。【结论】成功建立了小鼠肝脏原位循环灌流试验体系,获得了纯度和活性均较高的小鼠肝细胞,分选所得的小鼠肝细胞完全满足构建肝细胞蛋白质组表达谱试验的需要。     

家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养及鉴定

为了建立一种高效的子宫细胞分离培养方法,用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养家兔子宫细胞,分别以上皮细胞角蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白等为抗原的免疫荧光对分离培养的细胞进行鉴定,并采用流式细胞仪分析细胞纯度。结果表明,家兔子宫内膜上皮细胞培养24 h后大部分贴壁,培养3 d左右形成单层细胞集落,呈角蛋白阳性,细胞圆形或椭圆形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达96%以上;子宫内膜基质细胞培养0.5 h后即有贴壁,培养2 d后呈单层细胞集落状生长,呈波形蛋白阳性,细胞多边形或梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达95%以上;平滑肌细胞培养24 h后大部分贴壁,6~7 d融合成片,呈α-平滑肌肌动蛋白阳性,细胞大都长梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达98%以上。说明该方法能够成功分离并得到高产量、高纯度、高增殖能力的子宫内膜细胞及平滑肌细胞。     

鸡胚原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养与鉴定

[目的]本试验旨在建立一套稳定的鸡肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化和培养技术,为深入研究鸡舍空气污染物对鸡肺泡功能影响提供体外研究模型。[方法]采用Ⅰ型胶原酶对16日龄鸡胚的肺组织进行消化,经过差速离心和差速贴壁法分离细胞,采用鸡免疫球蛋白G(IgG)免疫吸附法纯化细胞,再利用免疫荧光检测和碱性磷酸酶进行细胞鉴定。[结果]培养18～24 h细胞伸展贴壁,细胞为多边形,呈岛屿状生长;培养24～72 h,细胞增殖代谢旺盛,胞核明显,胞浆丰富,细胞之间逐渐连接成单层;培养72 h后,细胞内颗粒物减少,细胞形态改变。免疫荧光检测可见上皮细胞标志物细胞角蛋白19(cytokeratin-19,CK19)的表达,碱性磷酸酶染色可见胞浆内出现弥散的红色或红棕色颗粒物。[结论]该方法是一种有效的鸡肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化和培养的技术,细胞产量高,纯度大,能够满足一般的体外研究。     

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

[目的]建立一种高效的水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分离培养方法,为胚胎着床和子宫内膜相关疾病的分子生物学机制研究奠定基础。[方法]采用酶消化、刮取、系列过滤和差速贴壁相结合的方法分离水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,用免疫细胞化学法和台盼兰染色法检测分离细胞的纯度和活率。[结果]成功分离培养出子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞;免疫荧光染色和细胞计数表明上皮细胞和基质细胞的纯度均达90％以上;台盼兰染色结果显示,上皮细胞的活率为91％,基质细胞的活率为78％。[结论]采用酶消化、刮取、过滤和差速贴壁相结合的方法可分离出高纯度的永牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

绵羊成肌细胞的纯化、培养、鉴定及其成肌诱导分化研究

为建立绵羊成肌细胞体外纯化、培养和鉴定的方法以及对成肌细胞进行成肌诱导分化的初步研究,本试验以绵羊胎儿为材料,采用胶原蛋白酶ⅠA消化分离成肌细胞,分别用Percoll分离液梯度离心和2次差速贴壁法纯化成肌细胞,采用免疫荧光方法检测成肌细胞的特异性标志蛋白Desmin以及RT-PCR鉴定成肌细胞的定型因子Myf5和MyoD1。细胞传至第二代后用CCK-8试剂盒检测细胞生长曲线。利用含2%马血清的培养基进行分化诱导并进行MYH1(Myosin heavy chain 1肌球蛋白重链1)免疫荧光染色。结果显示,梯度离心和差速贴壁法均可获得较高纯度的成肌细胞,纯度均在92%以上。RT-PCR结果显示细胞高表达Myf5和MyoD1。细胞符合正常生长规律,生长曲线近似S形。对成肌细胞进行诱导分化,大部分细胞融合为肌管,成肌特异性标志MYH1表达呈阳性。本研究获得了绵羊成肌细胞分离纯化培养及鉴定的方法、高纯度的绵羊成肌细胞系,为以后利用成肌细胞研究肌肉发育调控机理提供了材料。     

水牛肺泡巨噬细胞的分离、培养及鉴定

为了深入研究水牛巨噬细胞（Macrophage,Mφ）的生物学特性,探索一种简便的水牛肺泡巨噬细胞（Alveolarmacrophage,AM）分离、培养方法,采用肺气管冷PBS灌洗法分离获得水牛肺泡细胞,并进行鉴定和功能检测。结果表明,采用肺气管冷PBS灌洗法可获得大量贴壁细胞,经光学显微镜和电子显微镜观察,其形态具备巨噬细胞的典型特征;酸性磷酸酶和非特异性酯酶阳性率分别为（89.4±3.5）%和（83.6±3.4）%;细胞表面抗原MHCⅡ阳性率为（96.6±1.3）%;鸡红细胞吞噬率为（23.6±4.2）%,墨汁吞噬率为（92.3±0.6）%。可见,肺气管冷PBS灌洗法是一种获取水牛肺泡巨噬细胞的可行方法。     

山羊输卵管上皮细胞的分离与培养

【目的】分离并培养山羊输卵管上皮细胞,研究其生长特性。【方法】采用胰酶、胶原酶及机械刮取方法分离输卵管上皮细胞并分析培养效果;选择免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定;向培养液中添加下丘脑粗提物、胰岛素、EGF和血清,探讨其对输卵管上皮细胞体外培养的影响。【结果】胰酶对山羊输卵管上皮细胞的分离效果较差,胶原酶次之,机械刮取方法较好。机械刮取法分离的细胞以细胞团居多,接种后8~12 h开始贴壁生长,生长2~3d细胞呈现明显的铺路石形态。免疫细胞化学染色显示,细胞角蛋白阳性率在95%以上。上皮细胞培养体系中含少量血清及人EGF、胰岛素,能有效促进原代和传代输卵管上皮细胞的生长,以体积分数5%血清+EGF的培养效果较好。【结论】采用机械刮取法分离培养的输卵管上皮细胞,在体外可连续传到第8代,传代细胞活性强、纯度高,可为输卵管上皮细胞相关功能的研究提供材料。     

梅山猪骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性分析

为建立梅山猪骨髓间充质干细胞(BMSC)体外分离培养方法及对梅山猪BMSC的生物学特性进行分析,本研究采用全骨髓法分离培养并传代梅山猪BMSC,倒置相差显微镜下观察细胞形态,以计数法检测细胞增殖状况,流式细胞术检测细胞周期,细胞压片进行染色体分析,免疫细胞化学和RT-PCR法检测细胞表面标志和转录因子的表达情况,并检测成骨和成脂分化能力.结果显示:梅山猪BMSC体外生长良好,细胞形态呈成纤维细胞样,具有稳定分裂增殖能力;CD29、CD44、CD90等表面标志基因及Fou5F1、Sox2、Nanog等转录因子基因表达呈阳性,CD45、Lin28表达呈阴性;在特定诱导液作用下,BMSC可分化为成骨样细胞及成脂肪样细胞.采用全骨髓法成功分离培养出大量纯度较高的梅山猪BMSC,其生长状态良好,可作为后续BMSC相关研究的种子细胞.     

胚胎造血干Sca-1^＋细胞向肝细胞分化的研究

目的探讨胚胎造血干细胞抗原阳性(Sca-1~ )细胞亚群在合适的体外诱导体系下向肝细胞或肝细胞前体分化的可行性。方法免疫磁性分离法分离Sca-1~ 细胞,相差显微镜观察细胞形态,RT-PCR法检测细胞白蛋白(ALB)、转甲状腺蛋白mRNA水平表达,免疫组织化学法检测AFP和CK8/18蛋白水平的表达,以及检测细胞糖原染色和尿素合成功能。结果免疫磁性分离法分离Sca-1~ 细胞能达到(85.57±1.66)%的纯度(P<0.01),对分离前后细胞活力的影响小(P<0.05)。随着诱导分化时间延长,细胞形态明显向肝细胞变化,AFP表达消失、CK8/18蛋白表达升高,ALB、转甲状腺蛋白mRNA表达升高,且细胞糖原染色和尿素合成功能增强,逐渐向成熟肝细胞转化。结论免疫磁性分离法能够分离出较高纯度的胚胎造血干Sca-1~ 细胞,并能够向肝脏细胞分化。     

新生山羊肾小管上皮细胞的原代培养与鉴定

【目的】建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelial cell,RTECs)的分离培养方法。【方法】采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15 mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免疫组化和碱性磷酸酶染色鉴定,并进行透射电镜观察;用流式细胞仪检测RTECs的增殖周期和凋亡情况。【结果】胶原酶Ⅳ对RTECs的消化效果优于胶原酶Ⅰ,所得的细胞团块多,纯度高,细胞生长快,经孔径0.15 mm的筛网过滤后,RTECs的纯度达95%以上,并可连续传至第12代。分离获得的细胞经免疫组化法和碱性磷酸酶染色法鉴定呈阳性;透射电镜观察显示,细胞表面有微绒毛和桥粒连接。用流式细胞仪检测的结果显示,第4代新生山羊RTECs中G1期和S期细胞分别占细胞总数的25.01%和74.99%,G2/G1为1.97%,第10代细胞中G1期细胞和S期细胞均占50.00%,G2/G1为1.88%;第4代细胞的早期凋亡率在0.32%左右,而第10代可达3.7%,远高于第4代细胞。【结论】建立了增殖快、细胞活力高的山羊RTECs分离培养方法。