Bt毒蛋白Cry1Ab受体基因Bt-r3在大肠杆菌中的克隆和表达及特性分析

根据二化螟中肠Bt毒蛋白Cry1Ab的受体基因Bt-r3的cDNA序列设计特异引物,扩增得到编码Bt-R3蛋白胞外部分的目的片段(约4500bp).将目的基因酶切克隆到质粒载体prcHis-TOPO上,再将该质粒导入到感受态细胞TOP 10,经IPTG诱导、得到约为160 kD的表达蛋白.经Western印迹鉴定,结果表明表达产物能有效地结合Bt毒蛋白Cry1Ab,从而确认Bt-r3是Cry1Ab的受体基因.它们的结合部位位于Bt-R3蛋白的胞外结构域中.     

不结球白菜抗芜菁花叶病毒蛋白BcTuRsO的生物信息学分析

采用生物信息学方法,利用多种在线软件对不结球白菜抗芜菁花叶病毒(TuMV)蛋白BcTuRsO的系统进化、理化性质、亲水性、跨膜区、亚细胞定位、所含模体及蛋白质结构进行预测和分析。系统进化树分析结果表明,该蛋白在不同物种之间具有保守性。理化性质分析结果显示该酶含194个氨基酸,分子量为21 731.3,理论等电点pI值为6.60。TMpred跨膜分析结果显示,它含有1个显著的跨膜螺旋区,这个区域与ProtScale预测的疏水区基本重叠。用Target P server和WOLFPSORTserver程序预测该蛋白为细胞质蛋白。结构域分析结果显示该蛋白含多种磷酸化位点。二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。     

榛属ycf1基因生物信息学分析

为研究ycf1基因家族成员在榛属(Corylus)中的生理功能,利用榛属叶绿体基因组数据库,经过生物信息学分析,获得榛属ycf1基因家族成员的基因结构、定位和编码蛋白,经过多重序列比对进行进化和分类分析。结果表明,榛属叶绿体基因组中的ycf1基因家族成员不含有内含子;TMHMM跨膜区结构分析显示,榛属YCF1蛋白均不含有跨膜区;MEME保守结构域分析显示,榛属YCF1蛋白均含有3个保守结构域。研究结果对解析榛属YCF1蛋白的生物学功能提供重要的线索。     

Cry1Ia和Cry2Ab杂交分子的构建和表达

同源性较低的Cry杀虫蛋白之间的结构域交换突变体成功案例很少。选择2种氨基酸同源性很低且蛋白其他特点差异也较大的Cry2Ab和Cry1Ia为亲本,将它们的3个结构域(Domain I,II和III)互换,构建6种结构域交换突变体。将这些突变体在Bt菌株中表达,分析其表达稳定性,并比较不同温度条件下的表达情况。结果显示,6种突变体在28.5,32.0℃条件下,均能够稳定表达,且表达量较高。说明构建的6种突变体在Bt菌株中具有较好的表达稳定性,以此为基础可以进一步检测其杀虫活性等特性。     

转Bt基因抗虫玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

【目的】研究转cry1Ab杀虫蛋白基因玉米收获后玉米根茬及其根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态,比较两种Bt玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定玉米收获后根茬残体和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态。【结果】转Bt基因玉米根茬残体和根际土壤中杀虫蛋白是逐渐降解的,Bt玉米MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较高,降解的速度也较慢,收获后8个月时还不能完全降解;Bt玉米Bt11根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较低,降解速度比MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度快,到7个月时已检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。Bt玉米MON810根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解较Bt11的慢,MON810和Bt11根际土壤分别在8个月和7个月时检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。【结论】种植过Bt11和MON810抗虫玉米的田块,在第二年春播农作物已经出土时,其根茬和根际土壤中残留的Cry1Ab杀虫蛋白尚不能完全降解,还有少量残留。     

Bt Cry1类毒素共性结构域的分析、表达及鉴定

【目的】分析定位Bt Cry1类毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性结构域,克隆并表达共性结构域蛋白,为筛选Bt毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础。【方法】利用生物信息学和分子模拟技术,通过SWISS-MODEL同源建模分别对5种Cry1类毒素进行三维建模,并结合Ramachandran plot、ERRAT和Verify3D方法评价模型构象的合理性。通过分析比对5种Cry1类毒素的三维结构,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域。以含Cry1Ac基因的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种为模板设计引物,PCR扩增获得共性结构域DomainⅠ基因,将其经NcoⅠ和NotⅠ双酶切连接至原核表达载体pET-26b(+),构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ。重组质粒经菌液PCR、双酶切以及测序鉴定验证正确后,转化至E.coli BL21(DE3),经终浓度为1 mmol·L~(-1)的IPTG在20℃下诱导表达16h后检测共性结构域蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用His-Trap HP镍亲和柱纯化上清中的可溶性融合蛋白,经SDS-PAGE电泳、Western blot和ELISA试验验证纯化的共性结构域蛋白的生物活性。【结果】基于氨基酸序列及三维空间比对分析,发现5种Cry1类毒素的DomainⅠ的序列一致性最高,而且它们的DomainⅠ三维结构几乎完全重合,确定DomainⅠ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域,通过PCR、双酶切及测序鉴定成功构建原核表达载体pET-26b-DomainⅠ,经IPTG诱导表达、His-Trap HP镍亲和柱纯化获得了可溶性的DomainⅠ共性结构域蛋白,SDS-PAGE和Western blot证实表达的共性结构域蛋白的分子量约为33.4 kD,且能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应,ELISA试验证实共性结构域蛋白与5种Cry1类毒素特异性抗体均具有很强的结合能力,抗原表位分析结果显示共性结构域蛋白具有和完整的Cry蛋白存在多个潜在抗原表位位点的特征,抗原表位区域所占的比例分别为48.4%和63.6%,表明共性结构域蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。【结论】基于分子模拟与分子克隆技术,成功定位及表达纯化获得共性结构域蛋白,为下一步利用共性结构域为靶标分子制备广谱特异性识别Cry1类毒素抗体打下基础。     

Bt菌株中Cry1Ia和Cry2Ab结构域交换突变体的表达形式

前期构建了一系列Cry1Ia和Cry2Ab蛋白的结构域交换突变体,并在Bt菌株中获得了可观的表达。对6种突变体的表达形式及分泌与否进行了分析和检测。结果显示,6种突变体在Bt中以包涵体的形式存在于菌液沉淀中;这些包涵体与正常Cry蛋白形成的晶体不同,不能溶于Na2CO3缓冲液。蛋白印迹法检测结果显示,带有Cry1Ia分泌信号肽的突变体IAA,IIA和IAI蛋白未分泌到胞外,这可能是由于蛋白表达量过快,迅速聚集而形成包涵体,从而无法分泌到胞外。     

羊驼MC1R基因的扩增与生物信息学分析

为探究羊驼MC1R的生物学特性,扩增羊驼皮肤组织中MC1R基因cDNA序列,并运用生物信息学软件推测羊驼MC1R基因序列的特性及编码蛋白的理化性质、疏水性、跨膜区以及保守性结构域等。结果表明:羊驼MC1R基因与各物种的MC1R基因存在较高的同源性,MC1R编码蛋白的分子式为C1601H2538N410O413S22,是一个稳定的疏水蛋白,存在7个跨膜区域,主要定位于细胞膜上,是跨膜蛋白。功能域的预测发现,MC1R含有1个功能域,即7TM蛋白家族保守结构域,这与MC1R存在于黑色素细胞表面,接受α-MSH的信号,作为黑色素细胞接受机体激素调控的主要信号通路,进而调控毛色的功能相一致。羊驼MC1R的生物信息学分析可为以后实践中深入研究它的功能提供参考。     

Cry1Ia和Cry2Ab融合蛋白的表达

[目的]苏云金芽孢杆菌表达的杀虫蛋白Cry1Ia和Cry2Ab对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。为充分利用已有Cry蛋白,本文构建了两者的融合蛋白,并对融合蛋白的原核表达进行检测。[方法]本文将两个基因的编码基因,按照两种先后顺序拼接起来,获得cry1Ia-cry2Ab融合基因和cry2Ab-cry1Ia融合基因。另外,将Cry1Ia蛋白N端第一个α-螺旋(73个氨基酸)的编码序列删除后,接入cry2Ab基因5'端,获得第三个融合基因cry1IaD73-cry2Ab。将3个基因分别插入pHT304载体,并由cry1Ac基因的启动子和终止子调控其在Bt细胞中表达。[结果]SDS-PAGE结果显示,Cry1Ia-Cry2Ab、Cry2Ab-Cry1Ia和Cry1IaD73-Cry2Ab三个融合蛋白均能够在Bt细胞中表达,其测定分子量与预期大小一致,分别约152kDa、152kDa和144kDa。蛋白印迹法分析发现,在表达过程中,三种融合蛋白均有一定比例的降解。另外,不同温度对融合蛋白的表达也有不同程度的影响。[结论]本研究构建了3种融合杀虫基因并在Bt细胞中成功表达,为进一步解析这类融合蛋白的杀虫活性和机理奠定了基础。     

兰花磷酸肌醇特异性磷脂酶C基因家族生物信息学分析

【目的】为研究兰花(Phalaenopsis equestris)中PI-PLC基因家族各成员在兰花中的生理功能。【方法】利用兰花基因组数据库,经过生物信息学分析,获得兰花PI-PLC基因家族成员的基因结构、染色体定位和编码蛋白,经过多重序列比对进行进化和分类分析。【结果】结果表明:兰花基因组中含有3个PI-PLC家族基因成员,分别含有9~13个外显子。TMHMM跨膜区结构分析显示,兰花PI-PLC蛋白均不含有跨膜区;MEME保守结构域分析显示,兰花PI-PLC蛋白均含有4个保守的EF、X、Y和C2结构域。【结论】以上结果对解析兰花PI-PLC蛋白的生物学功能提供重要的线索。     

小鼠胚胎干细胞核心转录因子nanog靶基因Zbtb9的生物信息学分析

通过特异性引物用RT-PCR方法扩增Zbtb9基因。利用生物信息学对小鼠的Zbtb9基因启动子进行生物信息学分析,预测Zbtb9基因启动子位置和启动子区内含有的转录因子结合位点,以及nanog在Zbtb9基因转录调控中的作用及Zbtb9蛋白的基本性质。Zbtb9基因启动子区可能定位于转录起始点上游790 bp至1024 bp之间。启动子区内含有15个转录调控因子结合位点,nanog的作用靶序列位于Zbtb9基因启动子区与转录起始位点之间,提示nanog在Zbtb9基因转录调控中起作用,小鼠Zbtb9蛋白二级结构可能以螺旋为主,富含疏水性氨基酸;对Zbtb9基因疏水区的氨基酸进行跨膜区分析,提示可能是跨膜蛋白。经SMART分析,Zbtb9蛋白含有BTB/POZ结构域。     

保定苜蓿锌离子跨膜转运蛋白的生物信息学分析(英文)

[目的]对保定苜蓿锌离子跨膜转运蛋白(Zinc transporter,ZnT)进行生物信息学分析。[方法]利用保定苜蓿锌离子跨膜转运蛋白氨基酸序列,应用生物信息学软件预测了该蛋白质的理化性质、分子表面亲/疏水性及二级结构,并利用不同的在线工具对其跨膜区域结构进行了对比预测。[结果]ZnT蛋白是一个整体疏水性蛋白,含有408个氨基酸,理论等电点为5.94;3种不同的跨膜预测工具预测得到相同的结果,即其存在7个可能的跨膜疏水区域,二级结构中α-helix(Hh)占48.04%、Extended strand(Ee)占9.56%、Random coi(lCc)占42.40%。这与其跨膜蛋白的性质相一致。[结论]mZnT属于锌离子跨膜转运蛋白的CDF家族,负责将细胞膜内的Zn2+转运出细胞,从而降低Zn2+的浓度与毒害。     

黄芪AmPAL的生物信息学分析

[目的]为了研究黄芪苯丙氨酸解氨酶(AmPAL)基因序列的特点,[方法]本文通过生物学软件对其生物学信息进行分析。[结果]结果显示,AmPAL基因具有5’、3’UTR区,编码一个分子量为78.05kD、稳定的亲水性脂溶蛋白,此蛋白分布于细胞质中,没有发现其跨膜片段,含有较多的潜在蛋白翻译后修饰位点。以欧芹为模板用PDB数据库构建其三级结构,发现此蛋白为四聚体蛋白,具有6个保守结构域。[结论]这些参数为深入了解黄芪的AmPAL基因提供研究基础。     

核盘菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因的 预测与生物信息学分析

为了解磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTases)在核盘菌生理代谢与致病过程中的作用,在核盘菌全基因组中寻找PPTases同源物。利用同源比对的方法,预测出核盘菌中PPTases基因,进而分析其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、二级、三级结构和保守结构域,并对PPTases编码氨基酸进行遗传进化分析。结果表明,在核盘菌全基因组中预测存在3个PPTases基因同源物,分别命名为:Ss-Ppt1、Ss-Ppt2和Ss-Ppt3。3个蛋白均为亲水性的非分泌型蛋白,在其二级和三级结构中α螺旋结构和无规则卷曲占主要部分,且三者都含有PPTases的保守结构域SCOP和(或)ACPS。     

类植物乳杆菌L-XM1 plnBCD基因的生物信息学分析

为了解类植物乳杆菌L-XM1 plnBCD编码蛋白的生物学特性,并推测其功能,综合运用RPS-Blast、InterProscan和TMHMM Server等多种生物信息学软件预测分析plnBCD编码蛋白的理化性质、疏水性、磷酸化位点、保守性功能域及二级结构,并用Swiss-model同源建模。结果表明:plnB编码蛋白为疏水性蛋白,定位于细胞质膜上,有6个跨膜区、21个磷酸化位点和1个HATPase_c结构域,具有大多数组氨酸蛋白激酶的基本性质。其二级结构以α-螺旋和延伸链为主要构件,其空间结构与组氨酸蛋白激酶的结构特征一致。plnC及plnD编码蛋白均为亲水性蛋白,不具有跨膜区,定位于细胞质中,均具有1个REC和1个LytTR结构域。plnC及plnD编码蛋白与感应调节蛋白的空间结构具有较高的相似度。推测菌株L-XM1 plnBCD基因编码蛋白为群体感应调控系统组分。对plnBCD基因的生物信息学分析的研究可为发现新的群体感应系统和深入研究群体感应系统各组分的功能提供参考。     

不结球白菜热激蛋白BcHSP81-4基因原核表达及生物信息学

从不结球白菜Pol_CMS胞质不育系SSH差减文库中得到1条热激蛋白基因的EST序列,通过对该基因的NCBI网上BLAST比对发现,与热激蛋白的同源性最高,与拟南芥HSP81-4(AT5G56000)同源性高达96％,命名为BcHSP81-4。将BcHSP81-4基因片段连接到原核表达载体PGEX-4T-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,产生了预期大小的重组蛋白,进一步证明了该基因属于热激蛋白90家族。并采用生物信息学方法,利用多种在线软件对不结球白菜热激蛋白BcHSP81-4的理化性质、亲水性、跨膜区、亚细胞定位及蛋白质结构进行预测和分析。理化性质分析结果显示,该蛋白质含699个氨基酸,分子量为80 050,理论等电点pI值为4.95。TMpred跨膜分析结果显示,它含有1个显著的跨膜螺旋区,这个区域与ProtScale预测的疏水区基本对应。用TargetP server和WOLFPSORT server程序预测该蛋白质为细胞质蛋白质,二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。     

转基因植物中Bt Cry2Ab蛋白的抗原表位特征预测

[目的]通过生物信息学方法了解转基因作物中Bt Cry2Ab蛋白的二级结构、三级结构、B细胞抗原表位及T细胞抗原表位等结构特征,为今后的抗体设计奠定基础。[方法]以在NCBI数据库中获得Cry2Ab蛋白序列为材料,应用DNAStar中的多种方法预测其B细胞表位,并通过在线预测软件NetMHCII 2.2分析Cry2Ab蛋白与MHC-II类分子的结合能力,从而预测其T细胞抗原表位。[结果]对Cry2Ab蛋白B细胞抗原表位的预测表明,Cry2Ab蛋白的第208～215区域是潜在的B细胞抗原表位;对Cry2Ab蛋白与MHC-II类分子结合能力的分析表明,Cry2Ab蛋白的第177～185区域、299～307区域和255～263区域是潜在的T细胞抗原表位,暗示含有HLA-DRB10101和HLA-DRB10701等位基因的人群对Cry2Ab蛋白更敏感。[结论]该研究有助于深入了解Cry2Ab蛋白的生物学特征,为完善转基因食品过敏原性的评估方法提供新线索。     

转Bt基因玉米残体Cry1Ab蛋白在土壤中的残留动态

采用ELISA定量法研究了(28±1)℃下转Bt基因玉米植株残体不同组织所含Cry1Ab蛋白在黄褐土和红壤中的残留动态,并对其进行方程拟合。结果表明,转Bt基因玉米植株残体不同组织释放的Cry1Ab蛋白在不同土壤中的残留动态基本一致,均呈前期快速降低和后期稳定下降2个阶段,但同一组织释放的Cry1Ab蛋白在不同土壤中的残留变化速率存在显著差异,黄褐土中下降明显快于红壤,1周内表现尤为显著;不同组织释放的Cry1Ab蛋白在同一土壤中其残留差异显著,且受培养时间等因素的影响,总体表现为根>叶>茎,与初始时Cry1Ab蛋白土壤可提取量表现基本一致;双指数模型比移动对数模型和指数模型更符合转Bt基因玉米残体中Cry1Ab蛋白在土壤中的残留动态。     

沼泽红假单胞菌LuxR家族调控蛋白的生物信息学分析

LuxR家族调控蛋白调控革兰氏阴性细菌群体感应系统,从而影响细菌生物被膜的形成.利用在线生物信息学预测软件,分析LuxR家族调控蛋白序列,对其理化性质、亲水性/疏水性、亚细胞定位、信号肽、二级结构、三级结构、磷酸化位点、跨膜结构域和功能结构域进行分析和预测,为后续研究生物被膜形成机制奠定基础,也为生物被膜增强剂的开发提供新的思路.结果表明:LuxR家族调控蛋白为不稳定的亲水性蛋白;定位在细菌的细胞质中;无信号肽结构,推断其为非分泌性蛋白;二级结构中含有α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲等结构元件;α-螺旋和无规则卷曲对三级结构的稳定和功能发挥具有重要意义;含有5个磷酸化位点,其中丝氨酸磷酸化位点包括第79位、第165位和第171位氨基酸,其中苏氨酸磷酸化位点包括第90位和第211位氨基酸;无跨膜结构域,推测LuxR家族调控蛋白不属于跨膜蛋白;LuxR家族调控蛋白参与细菌群体感应系统,含有2个保守结构域,分别为Autoind_bind和HTH_LUXR,该蛋白通过这2个保守结构域起到转录调控的作用.     

紫花苜蓿蛋白质二硫键异构酶mPDI的生物信息学分析与同源建模

紫花苜蓿蛋白质二硫键异构酶的基因已经被克隆测序。利用其mRNA及氨基酸序列,应用生物信息学软件预测了该蛋白质的理化性质、亲/疏水性、信号肽、二级结构、卷曲螺旋结构、跨膜区域、糖基化位点、活性位点、亚细胞定位、功能结构域及高级结构。结果表明,该蛋白质是一个整体疏水性蛋白,细胞定位为粗面内质网,含有512个氨基酸,理论等电点为4.98,信号肽位于1～24号氨基酸;二级结构中α-螺旋占26.37％（135AA）,无规则卷曲占53.32％（273AA）,延伸链占20.31％（104AA）;包含3个卷曲螺旋结构,3个糖基化位点,2个硫氧还蛋白结构域,2个硫氧还蛋白活性位点。Ramachandram结构检测表明此模型的三维结构符合立体化学能量规则。