木聚糖酶基因的克隆与表达

用PCR技术从桔青霉基因组DNA反转录扩增得到木聚糖酶编码基因xyl,并构建基因表达载体p PAL7-xyl重组质粒,转化受体菌E.coli BL21进行原核表达分析。IPTG诱导6 h酶活性达到最高,为2.07 IU/m L;表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,在22 ku处呈现蛋白条带,与理论的蛋白大小相一致,37℃条件下诱导6 h蛋白表达量最高;同时进行构建基因表达载体p PIC9K-xyl重组质粒,转化受体菌毕赤酵母GS115作真核表达分析,经甲醇诱导96 h后酶活性达到最高,为23.84 IU/m L。     

巴什拜羊BPI基因的克隆与真核表达

从巴什拜羊外周血多形核粒细胞(PMN)中提取总RNA,经RT-PCR扩增出巴什拜羊BPI基因片段,将其克隆至p PIC9K载体中,构建真核表达质粒p PIC9K-BPI,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,电转化至毕赤酵母GS115中并用甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定重组BPI蛋白的表达,通过微量肉汤稀释法检测重组BPI蛋白的抑菌活性。结果表明:RT-PCR扩增获得597 bp巴什拜羊BPI基因;经PCR、酶切及测序鉴定证实成功构建BPI基因的真核表达载体,SDS-PAGE检测结果表明,重组BPI蛋白成功表达,通过抑菌试验表明表达的重组BPI蛋白具有明显抑菌活性。     

His标签的水稻硅转运蛋白表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

以水稻根系c DNA为模板,PCR扩增含His标签的Lsi1基因开放阅读框,并将该基因克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PIC9k中,PCR及测序验证重组质粒p PIC9k-Lsi1目的基因序列.将验证正确的重组质粒p PIC9k-Lsi1通过SacⅠ酶切线性化,电转到毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过MD/MM板筛选出甲醇利用快型的酵母转化子,再通过不同浓度梯度的G418平板筛选多拷贝转化菌株.提取酵母基因组,PCR验证正确的菌株即为工程菌(GS115/p PIC9k-Lsi1).用1%甲醇诱导该工程菌72 h后,收集上清,经SDS-PAGE检测到位于32.8 ku处的目的蛋白即为Si转运蛋白(Os Lsi1).     

柔嫩艾美耳球虫微线4N端蛋白序列分析与真核表达

[目的]为了获得重组柔嫩艾美耳球虫微线4N端蛋白.[方法]根据Genebank设计柔嫩艾美耳球虫微线4N端基因特异引物,RT-PCR扩增该基因,经Blast与Genebank公布的该基因比对,而后构建该蛋白的真核表达载体pPICZaA/EtMIC4N,用毕赤酵母表达系统小规模表达该蛋白,利用SDS-PAGE和Western Blot对表达的蛋白鉴定,再以摇瓶的方式进行大规模表达.[结果]RT-PCR扩增获得柔嫩艾美耳球虫微线4N端基因序列,大小为773 bp,经比较,与目的基因开放阅读框相似度99.5％,其中有4个碱基发生突变,1个gap.PCR证实成功构建真核表达载体,电转后的毕赤酵母用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot发现在上清中有45 kD的条带,说明成功表达该蛋白,且该表达系统可持续获得较高纯度的目的蛋白,以摇瓶的方式进行大规模表达,每升能够纯化到约10 mg的目的蛋白.[结论]毕赤酵母成功表达重组柔嫩艾美耳球虫微线4N端蛋白,为该蛋白免疫原性的研究奠定基础.     

人/猴免疫缺陷病毒SHIV衣壳蛋白p27的表达纯化及活性鉴定

利用PCR技术从质粒SHIV89.6P中扩增p27gag基因,并克隆入pMD18-T载体,测序鉴定;将p27gag基因插入表达载体pET32aT7启动子下游,构成重组质粒pET32a-p27并使其在大肠杆菌BL21中高效表达,最后利用固定化金属离子(Ni2+)配体亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白,Western Blot检测活性。结果显示,融合蛋白p27经SDS-PAGE电泳观察可见45ku的明显条带,与预期分子质量大小一致且多以可溶形式表达,目的蛋白占菌体总蛋白的36.8%;经镍柱纯化,获得目的蛋白p27纯度可达98%;经Western Blot试验检测,证明此融合蛋白p27能与SHIV阳性血清发生特异性反应,具有较好的抗原活性。该研究为进一步开发早期诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定了初步基础。     

内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达

将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达情况。结果表明:SDS-PAGE和Western blot证实表达的融合蛋白分子量正确,抑菌试验表明融合蛋白对微球菌具有良好的抑菌效果。说明融合基因在毕赤酵母中成功表达,为后继的纯化工作及新型毕赤酵母表达载体的构建奠定基础。     

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。     

牦牛IFN-β基因在毕赤酵母中的分泌表达

用真核表达引物从pGEM-yakIFN-β重组质粒中扩增出牦牛IFN-β基因,将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E.coli的JM109中,得到pPIC9K-yakIFN-β重组表达质粒.通过电击法将经SalⅠ线性化的pPIC9K-yakIFN-β质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中,采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,利用甲醇诱导表达,分泌表达产物用MTT法检测其生物学活性.经SDS-PAGE电泳分析表明:表达出约22ku大小分泌于胞外的牦牛IFN-β蛋白分子量,比理论值稍大;MTT结果表明:纯化的重组yak-IFN-β蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性.     

pPIC9K-IL-2重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

根据Ovis aries interleukin(IL-2)序列设计1对引物,用PCR法扩增的目的基因进行克隆,将测序正确的IL-2基因片段和表达载体pPIC9K同时双酶切后相连,构建pPIC9K-IL-2重组表达载体.将线性化的载体pPIC9K-IL-2电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,用G418(4g/L)筛选到多拷贝菌株,进行不同条件下甲醇诱导表达.结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量约为18ku目的蛋白表达条带,本研究成功构建了高效表达重组羊IL-2毕赤酵母菌株,为新型细胞因子佐剂的研发奠定了基础.     

鸡源志贺菌IpaC基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

为使IpaC基因表达产物保持天然的生物学活性,实现在酵母表达系统中高效表达,本研究在不改变IpaC蛋白氨基酸序列的情况下,根据酵母密码子偏爱性优化合成IpaC#基因,分别构建真核表达载体pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#,然后将线性化重组质粒电转化至毕赤酵母X-33中,对阳性转化子用SDS-PAGE及Westernblot检测其表达产物。结果表明,经SDS-PAGE及Westernblot检测,仅在pGAPZαA-IpaC#/X-33重组菌表达产物菌体沉淀中检测到大小为70ku的目的蛋白,实现了鸡源志贺菌IpaC#基因在毕赤酵母中的胞内表达,从而验证毕赤酵母表达系统与外源基因序列的相关性,为进一步提高鸡源志贺菌IpaC基因在毕赤酵母中的高效表达提供科学依据,对研究该病的发病机制具有重要意义。     

O型口蹄疫病毒VP1-2A基因及多表位片段在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统串联表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因及O型FMDV多表位片段(CTE),将O型FMDVvp1基因和CTE多表位片段克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-VP1-2A-CTE并测序。经SalI线性化后,通过电击转化法将重组质粒导入毕赤酵母GS115中,并对表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组质粒通过电转进入毕赤酵母后,能表达相对分子量为41.8KD(CTE)和26.5KD(VP1-2A)的蛋白,经Western blot分析,两种蛋白均具有抗原性。在毕赤酵母中成功地表达O型FMDVVP1-2A蛋白和多表位片段(CTE),为研制新型口蹄疫的基因工程疫苗奠定了基础。     

来航鸡FOXL2基因的真核表达及纯化

【目的】对来航鸡FOXL2基因进行真核表达及纯化,为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据GenBank已发表的来航鸡FOXL2基因序列(GenBank登录号:JF_708868.1)设计引物,以来航鸡全血DNA为模板,PCR扩增FOXL2基因,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后定向克隆于pPICZαA中,获得pPICZαA-FOXL2真核表达载体。将pPICZαA-FOXL2转化毕赤酵母菌GS115,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。【结果】克隆了918bp的FOXL2基因;成功构建了pPICZαA-FOXL2真核表达载体;实现了FOXL2基因在毕赤酵母菌GS115中的融合表达,获得了分子质量约为37ku的重组蛋白FOXL2,经Western blotting检测其具有较好的生物学活性。【结论】成功地在毕赤酵母中表达了来航鸡FOXL2基因。     

雪莲类PEBP基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了构建雪莲类PEBP基因真核表达载体,在毕赤酵母中表达并鉴定.将雪莲类PEBP基因开放阅读框序列克隆到真核表达载体pPIC9k上,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞内,利用筛选到的Muts(methanol utilization slow)重组酵母株进行表达,经SDS-PAGE分析,表达产物置于低温条件下进行抗冻试验.结果在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为20 kD,与预期相符,上清液抗冻检测表明PEBP具有一定的抗冻性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达.该研究成功构建了真核表达载体pPIC9k-PEBP,获得了表达产物,并为进一步研究雪莲类PEBP基因的抗冻功能打下基础.     

罗非鱼热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达与纯化

以尼罗罗非鱼血液mRNA反转录获得编码罗非鱼Hsp70完整cDNA,重组构建罗非鱼真核表达载体pPIC9K/rtHsp70;在毕赤酵母Pichia pastoris KM71中表达重组罗非鱼的热休克蛋白70（rtHsp70）,对表达上清液进行SDS-PAGE及Western blot分析;采用亲和层析、HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化目的蛋白。结果表明：克隆至pMD载体上的基因与目的基因完整编码区序列完全一致;诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western blot分析,上清液中蛋白条带大小与目的蛋白相对分子质量大小一致;每升诱导上清液可以获得约2 mg纯化蛋白。本研究中获得的rtHsp70毕赤酵母工程菌及纯化的rtHsp70为后期rtHsp70-肽疫苗研究奠定了基础。     

鸡神经肽Y（NPY）基因在毕赤酵母中的表达

为通过毕赤酵母的表达获得鸡NPY蛋白,根据GenBank上的鸡NPY基因序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性合成编码鸡NPY蛋白的基因,将其插入真核表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-NPY,并将重组质粒电转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-NPY,用终浓度为1%的甲醇诱导表达阳性转化菌,用Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建表达载体pPICZαA-NPY,转化后的重组酵母菌成功分泌鸡NPY蛋白,获得分子量约为35 kDa的鸡NPY蛋白。     

水稻HL-CMS中线粒体基因orf216原核表达载体构建及蛋白纯化

将orf216基因克隆到含有组氨酸标签的原核表达载体pET-30a(+)中,得到重组质粒pET-30a(+)-orf216,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys菌株感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物。通过Ni-NTA亲和层析系统纯化获得高纯度目的蛋白。研究结果表明,成功构建了pET-30a(+)-orf216原核表达载体并转化大肠杆菌。SDS-PAGE和Western Blot结果显示30 ku处有单一条带,确定其能高效表达并且诱导表达产物为ORF216蛋白。同时对利用Ni-NTA层析系统纯化高纯度高含量ORF216融合蛋白的条件进行了优化。     

鸡白细胞介素-2在毕赤酵母中的表达

将鸡白细胞介素-2（ChIL-2）基因插入酵母分泌型表达载体pPIC9K构建重组表达载体pPIC9K／ChIL-2,通过电转化构建毕赤酵母（Pichia methanolica）GS115甲醇利用型重组表达菌株．经SDS—PAGE与Western blot分析,证实ChIL-2基因在重组GS115中成功表达出约16ku与14ku两条特异性条带,这与天然ChIL-2相对分子质量大小一致,提示ChIL-2可能为糖基化蛋白质．     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。     

在毕赤酵母中表达人溶菌酶蛋白的研究

将化学合成的人溶菌酶基因htYZ（444bp）构建到毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ上;载体质粒用SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母菌株GS115,在含Zeocin的抗性培养基筛选后PCR鉴定获得了9株重组菌株。重组菌株经甲醇诱导后取表达上清液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,重组hLYZ在毕赤酵母中成功表达,在诱导60h时表达量最高。用镍亲和层析柱纯化重组hLYZ,用Bradford法测得其含量约为324mg·L^-1。比浊法活性测定结果显示所表达的重组人溶菌酶活性达到4473U·mL^-1。本研究利用毕赤酵母分泌型表达载体成功表达了重组人溶菌酶,井探索了简单有效的纯化和活性测定方法,为利用毕赤酵母系统规模化生产重组人溶菌酶奠定了技术基础。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株δC蛋白基因在毕赤酵母中表达

将番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC蛋白基因与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9Kσ-C,转化大肠杆菌DH5α,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9Kσ-C用内切酶SacⅠ线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合,采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了高效表达,并且具有免疫反应性。