甘蔗NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

根据已知植物(拟南芥、烟草和亚麻)抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物, 从甘蔗高抗黑穗病品种NCo376的基因组DNA和cDNA中扩增出11条抗病基因同源序列, 其中5条来自基因组DNA(EF059973, EF059974, EF059975, EF059976和EF059977), 6条来自cDNA(EF155648、EF155649、EF155650、EF155651、EF155652和EF155653)。序列分析表明, 这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守结构域P-loop, Kinase-2a, Kinase-3a 和疏水结构域。聚类分析表明, 11条RGA同RPS2和XA1聚为一类, 而N和L6则单独聚为一类。所有11条抗病基因同源序列中, kinase-2(LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸。定量PCR分析表明, 编号为EF059974的PIC基因的表达不仅受黑穗病菌胁迫的影响, 而且受水杨酸的诱导和过氧化氢的抑制, 也具有抗病基因组织特异性和组成型表达特性。     

亚麻木质素合成途径中关键酶基因片段的克隆与序列分析

亚麻是一种重要的韧皮纤维作物, 木质素对亚麻纤维的性能和品质具有较大影响。以亚麻(Linum usitatissimum L.)茎秆表皮细胞的mRNA为模板, 利用木质素合成途径中关键酶基因的同源基因保守序列设计简并引物, 通过RT-PCR扩增, 电泳获得13个特异带。分别将这些DNA片段连接到T载体后转化大肠杆菌, 从重组质粒转化菌分别挑取5~8个单菌落测定插入片段序列, 得到关键酶基因新的片段序列8个。生物信息学分析结果表明, 这些新片段分别属于3个基因家族。其中, 2个CCoAOMT基因片段(GenBank登录号为EF214740, EF214741), 3个4CL基因片段(GenBank登录号为EF214737, EF214738, EF214739), 3个F5H基因片段(GenBank登录号为EF214745, EF214746, EF214747), 推测亚麻中这几个木质素代谢关键调控酶基因存在多基因家族。新获得的基因片段序列为进一步克隆全序列和了解调控亚麻木质素的生物合成奠定了基础。     

PPARα基因对安卡×固始鸡资源群胴体品质的遗传效应分析

由793只安卡×固始鸡F2资源群为试验材料,采用PCR-SSCP技术和DNA测序的方法对PPARα基因的编码区进行SNP检测。结果发现,外显子4存在1个多态性位点,经限制性内切酶BspHⅠ酶切后显示出EE、EF、FF 3种基因型。利用SAS8.0软件分析不同基因型对胴体品质的影响,结果表明,PPARα基因NC_006088:T32311C的多态性显著影响鸡的腹脂重和腹脂率(P0.05),而对屠体重、皮下脂肪厚、肌间脂肪带宽、半净膛重和全净膛重等无显著影响(P0.05)。EE型和EF型的腹脂重和腹脂率显著高于FF型(P0.05),而EE型和EF型之间无显著差异(P0.05)。PPARα基因影响脂肪代谢,可以作为分子标记用于鸡脂肪性状的分子标记辅助选择。     

茉莉花实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证

为筛选适合茉莉花的内参基因,以5种组织(根、茎、嫩叶、成熟叶、花)和4个发育阶段的花(幼蕾期、膨大花蕾期、最长花蕾期和初绽期)为试验材料,选择较常见的8个候选内参基因进行引物特异性分析,结果显示,8个内参基因均扩增出单一条带,溶解曲线均只有明显的单一峰。采用qRT-PCR技术分析8个内参基因在不同样品中的表达量,结果显示,内参基因在不同样品中的表达量存在差异,各基因在花中的表达量均显著低于其他样品。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件对基因的表达稳定性进行评价,并通过RefFinder对表达稳定性进行综合分析,结果表明,适用于不同组织(有花组)的最优内参基因为SAND和UPL7;适用于不同组织(无花组)的最优内参基因为UPL7和GAPDH;而适宜不同发育阶段花的最优内参基因为Actin和EF1α。进一步利用JsDXS和JsPAL2对筛选的内参基因进行验证,结果显示,以稳定性好的Actin、EF1α及Actin+EF1α组合为参照时,JsDXS和JsPAL2在花发育不同阶段的表达水平的变化趋势基本一致,而用最不稳定的PP2A为参照时,花发育不同阶段的表达水平的...     

山羊FGF18基因变异及其对羊绒性状的影响

为了研究FGF18基因在山羊中的多态性以及对羊绒性状的影响,通过PCR-SSCP结合测序的方法对FGF18基因3个区域(Exon 3、Exon 4和Exon 5)在3个山羊群体(陇东绒山羊、柴达木绒山羊、中卫山羊)中的多态性进行检测,并分析基因多态性与陇东绒山羊羊绒性状的关联性。结果显示,FGF18基因在3个山羊群体中均较保守,只在Exon 5发现一个同义突变(c.498T>C)。c.498T>C位点对应的3种基因型EE、EF和FF在3个群体中均被检测到,且均处于Hardy-Weinberg平衡。等位基因E在3个群体中均为优势等位基因;陇东绒山羊、柴达木绒山羊和中卫山羊的优势基因型分别为EF、EE和EF。FF型陇东绒山羊的产绒量和绒层高度显著高于EE型和EF型山羊(P<0.05)。综上,山羊FGF18基因呈中度多态,c.498T>C位点与陇东绒山羊的产绒量和绒层高度呈显著相关,提示若以这2个性状为选育目标,FGF18基因可以作为分子改良的候选基因。     

香蕉抗病基因类似序列(RGA)的克隆与分析

根据植物NBS类抗病基因保守氨基酸序列P-loop和疏水氨基酸GLPL保守序列设计简并引物,从香蕉抗镰刀菌枯萎病(4号小种)材料IN21(Musa spp.cv). 'IN21',AA)和Rose(M.spp.cv.'rose',AAA)的基因组DNA中扩增获得4个RGA,四条DNA片段长度分别为527 bp、537 bp、534 bp和547 bp,分别命名为"RGA-IN1"、"RGA-IN2"、"RGA-Rosel"和"RGA-Rose2"(GenBank Accession:EF488469、EF488470、EF488471和EF488472);同源性分析表明,均与已报道的植物抗病基因有不同程度的同源性,具有P-loop、Kinase-2、RNBS-B(Kinase-3a)以及GLPL等保守氨基酸序列,属于non-TIR-NBS类候选抗病基因.     

甘蔗斑茅的杂交利用及其杂种后代鉴定系列研究(二):甘蔗斑茅远缘真实杂种的分子鉴定

根据斑茅ITS区序列设计编号为EF1／ER1和编号为EF2／ER2的两对引物,经在甘蔗及其近缘属植物间ITSPCR扩增,证明这两对引物是斑茅特异引物,其中引物EF1／ER1在斑茅多态性研究中扩增出5种带型,而引物EF2／ER2扩增出3种带型;同时,利用这两对引物对甘蔗(拔地拉)与斑茅杂交的9个F1,甘蔗斑茅真实杂种(崖城96-66、96-46)与CP84-1198的36个BC1以及崖城95-41与内江57-416的12个BC1,15个曾被认为具有斑茅血缘的品系进行分子鉴定,结果表明,两对引物的鉴定结果基本一致,其中对斑茅F1的分子鉴定结果与前人(沈万宽)的同工酶鉴定结果相一致,对15个曾被认为具有斑茅血缘的品系进行鉴定结果显示大部分品系为假杂种。     

沙地云杉种子内参基因的筛选与验证

为筛选出沙地云杉(Picea mongolica)种子成熟过程中均可稳定表达的内参基因,本研究以沙地云杉种子不同发育时期的样本为研究对象,采用RT-qPCR技术,检测沙地云杉种子转录组数据库中GAPDH、EF1α、CYC、Actin等8个候选内参基因在种子发育过程中呈现的综合表达水平,并通过内参基因分析软件(geNorm, NormFinder, BestKeeper)对其稳定性统一评估。结果表明,候选内参基因中稳定性最好的是CYC、EF1α和GAPDH。分别以CYC、EF1α和GAPDH作为内参基因对沙地云杉胚胎发育关键调控基因LEA1(Late embryogenesis abundant protein)和WOX9 (WUSCHEL related homebox)进行了定量分析,其表达趋势基本一致。本研究结果将对沙地云杉及近缘物种的分子育种研究提供参考。     

百合体胚诱导、发育及不同组织实时定量PCR内参基因筛选

本研究筛选观赏百合(Lilium oriental×Trumpet hybrid)体胚诱导、发育不同时期及不同组织中稳定表达的内参基因,以观赏百合品种‘Conca D'Or’为研究对象,采用实时荧光PCR分析百合8个候选内参基因(18S,ɑ-TUB,GAPDH,UBQ,b HLH,ACT,EIF,EF1)在体胚诱导不同时期、体胚发育不同阶段及不同组织中的扩增效果,并采用Genorm、Norm Finder和Best Keeper三种软件对候选内参基因在百合中的表达稳定性进行综合评价。结果表明:b HLH在体胚诱导、发育及不同组织中的稳定性优于其他基因;GAPDH及ACT在观赏百合‘Conca D'Or’上扩增效果差。将体胚诱导不同时期、体胚发育不同时期及不同组织的扩增数据放在一起分析,Ge Norm和Norm Finder软件评估最适内参基因为b HLH和EIF,Best Keeper软件评估最适内参为EF1和b HLH。本研究建立了观赏百合实时荧光定量PCR内参基因的筛选体系并选出观赏百合体胚诱导、发育及不同组织表达最稳定的前三个内参基因分别为b HLH、EIF和EF1。     

不同启动子对HA-VP2重组杆状病毒蛋白表达的影响

为比较不同启动子对传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白表达的影响,择优表达体系。本研究将添加了表位附加标记HA-TAG的IBDV-VP2基因整合至含有CMV、CBA和EF1α启动子的重组转移载体中,构建HA-VP2重组杆状病毒,并通过侵染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO)分析蛋白表达水平,以确定最优启动子。用Gel-Pro analyzer 4.5软件分析Western blotting条带。结果表明,含有CMV、CBA及EF1α启动子的重组杆状病毒所表达的HA-VP2蛋白强度分别为270.61、290.26及83.45,且各启动子活性差异显著(P0.05),其中CMV与CBA启动子的活性相近能够较高效率地表达HA-VP2蛋白,但EF1α启动子活性较以上2种启动子活性较低。本研究通过比较分析不同启动子对蛋白表达水平的影响,以此择优表达体系,为禽类基因工程疫苗的发展提供新思路。     

鸡Muslin cDNA克隆与序列分析

基于电子延伸序列,本试验克隆并分析了鸡Muslin基因。肌肉组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coliDH5α,检测阳性克隆并测序;克隆的Musclin基因与人、大鼠、小鼠同源性分别为74%,73%,70%,推测的氨基酸序列同源性分别为58%,54%,50%,氨基酸序列含有"KKKR"结构和与小鼠ANP,BNP,CNP蛋白的同源性区域。试验成功克隆了鸡Musclin基因并注册GenBank(EF551041)。     

玉米蛋白激酶基因ZmPti1-1的cDNA克隆及其表达特性

应用电子克隆的方法获得了玉米的一个Pti1（Pto-interacting 1）同源基因的全长cDNA,命名为ZmPti1-1（GenBank接受号为EF158035）。推断ZmPti1-1蛋白含有362个氨基酸,分子量为39．00kDa,p1为8．14,包含蛋白激酶催化结构域保守的11个亚结构域。在水杨酸（Salicylic acid,SA）、甘露醇、氯化钠、脱落酸（Abscisic acid,ABA）和4℃低温的诱导下,ZmPti1-1在玉米幼苗叶片中的表达量明显上调。同时,在玉米不同发育时期、不同组织器官内,ZmPti1-1的表达水平也有很大差异,在子房中表达量最高,在雄蕊中检测不到表达。试验结果表明,ZmPti1-1是一个玉米类Pti1基因,响应生物胁迫和非生物胁迫的诱导。     

彩色马蹄莲不同品种和组织qRT-PCR内参基因筛选

为筛选出彩色马蹄莲不同品种和组织最佳内参基因,以彩色马蹄莲不同品种和不同组织为研究材料,运用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)结合3个内参基因稳定性分析软件(geNorm, NormFinder和BestKeeper),对彩色马蹄莲6个候选内参基因(18S rRNA, ACT, EF1α, GAPDH, LEU和TUB)的表达稳定性进行了分析。通过geNorm软件计算出彩色马蹄莲不同品种和组织的最适内参基因数目均为3个;综合3个软件的分析结果,筛选出彩色马蹄莲不同品种中稳定性最好的3个基因为18S rRNA、LEU和GAPDH;不同组织中稳定性最佳的3个基因为ACT、EF1α和18S rRNA。本研究为彩色马蹄莲品种间叶片表型差异、种球发育、赤霉素敏感差异等机理研究提供参考依据。     

棉花中两个新的F-box蛋白基因的克隆与表达分析

 以棉花EST序列分析为基础,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花中克隆了2个新的F box蛋白基因,分别命名为GhFB1 (GenBank核酸数据库登录号：EF419428)和GhFB2 (GenBank登录号：EF503623)。GhFB1cDNA全长866bp,编码162个氨基酸;GhFB2 cDNA全长657bp,编码161个氨基酸,而且两者均含有植物F-box蛋白家族特有的F-box结构域。序列比较分析表明,GhFB1和GhFB2蛋白与水稻OsGID2,拟南芥AtSLY1具有高同源性,是棉花中F-box蛋白家族的新成员。RT-PCR结果表明,GhFB1和GhFB2在根、下胚轴、叶、茎、花和纤维中都有表达,而且均在棉花纤维起始和伸长时期有优势表达,推测这2个基因在棉纤维早期发育中可能起重要作用。     

甜樱桃花芽不同发育时期内参基因的筛选与验证

为了筛选甜樱桃花芽不同发育时期均稳定表达的内参基因,以甜樱桃桑提娜和黔樱一号不同发育时期花芽为材料,通过qRT-PCR技术检测28S rRNA、EF1-a1、EF1-a2、UBC、RPL13、18S rRNA、RSP3、CYP40、ACT2和α-TUB3等10个常用看家基因的表达水平,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper综合评价其表达稳定性。结果表明,EF-1a2和RSP3在所有样品中稳定性最好。分别以EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3作为内参基因检测不同发育时期花芽生长素运输载体AUX1基因及生长素响应因子ARF基因的表达模式,该2个基因在不同内参基因标定下表达模式相同。表明EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3可作为甜樱桃花芽不同发育时期的内参基因。     

猪Cst B基因5'侧翼区序列的克隆研究

以大白猪cDNA为模板,根据GenBank上提供的猪exon1序列设计引物,采用RACE克隆方法,首次获得猪Cst B基因5'侧翼序列,得到了共44bp的序列,提交GenBank收录(GenBank登录号:EF483823)。     

白叶枯病菌侵染下的水稻内参基因稳定性

水稻白叶枯病是由黄单胞菌水稻致病变种引起的一种细菌性枯萎病害,严重危害水稻产量。水稻受白叶枯侵染后,通过对相关基因表达变化进行检测,是研究水稻-白叶枯病菌分子互作机理的一种重要手段。为了筛选出稳定表达的内参基因,以确保后续基因表达分析结果的可靠性,本研究以接种了白叶枯病菌PXO61、PXO99的水稻叶片为研究材料,在侵染后不同时间点取样,对6个常用的水稻内参基因(TUB,EF1α,UBQ5,ACT,18Sr RNA和GAPDH)的表达进行qRT-PCR检测并用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper三种软件对6对常用内参基因的稳定性进行了分析。结果发现:6个内参基因在两种白叶枯病菌侵染后的表达量变化均有差异;综合三种软件算法,受白叶枯PXO61和PXO99侵染后水稻叶片中表达最稳定的基因为EF1α、ACT和TUB,为水稻响应白叶枯病菌基因表达及其进一步的功能研究提供了参考和借鉴。     

棉纤维发育相关基因GhCHS、GhCPI的克隆与鉴定

  以陆地棉李氏超短纤维突变体Li₁li₁自交后代野生型li₁li₁和超短纤维突变体Li₁li₁开花后4 d的胚珠纤维的复合体的RNA为探针,通过基因芯片的方法筛选优质材料7235棉纤维伸长、次生壁加厚不同发育时期混合cDNA文库,分离出两个在两种材料中差异表达的cDNA序列,分别命名为GhCHS（GenBank登录号：EF643506）和GhCPI（GenBank登录号：EF643507）。RT-PCR分析表明：开花后4 d,GhCHS,GhCPI在陆地棉李氏野生型li₁li₁纤维中的表达量低于超短纤维突变体Li₁li₁。Southern杂交结果表明两个基因在陆地棉基因组中都存在两个拷贝     

智海剑教授课题组发现预防大豆花叶病毒新途径

正南京农业大学农学院智海剑教授课题组于6月29日在《Plant Physiology》(IF=6.841)上在线发表研究论文"The potyviral P3 protein targets EF1A to promote the unfolded protein response and viral pathogenesis",栾鹤翔博士为该论文第一完成人,南京农业大学为第一完成单位,智海剑教授为第一通讯作者。大豆是我国重要的植物蛋白和油料来源,而大豆花叶病毒(SMV)严重影响大豆的产量和品质。P3是SMV的致     

野大麦HbCBL1和HbCBL2结构与亚细胞定位分析

利用RT-PCR从野大麦cDNA扩增出两个基因HbCBL1和HbCBL2.蛋白结构分析表明,其具有典型的EF手臂,且HbCBL1的N-端含有豆蔻酰化结构域.为了明确野大麦HbCBL1和HbCBL2结构对其在植物体内亚细胞水平分布的作用,分别构建了以35S为启动子驱动的与绿色荧光蛋白基因GFP融合的植物表达载体,通过基因...