仲彬草属植物ITS序列PCR产物直接测序与克隆测序比较分析

通过PCR产物克隆测序和直接产物测序的方法对禾本科小麦族仲彬草属10个物种的rDNA内转录间隔区(ITS)及5.8SrDNA进行了序列测定和系统发育分析。结果表明:该属植物ITS区直接产物测序与克隆测序存在较大差异,克隆测序序列反映的系统发育关系与形态学、地理分布、细胞学、分子标记分析结果基本一致。因此,采用克隆测序的方法对仲彬草属植物系统发育分析比直接测序方法更为可靠。     

广西草龟GH基因全序列克隆及测序分析

[目的]了解广西草龟生长激素(GH)基因全序列结构特点及其与其他物种间的关系,为进一步研究GH基因的结构、功能、遗传变异规律及其与生产性能的关系提供科学依据.[方法]根据GenBank上已公布的黄喉拟水龟GH基因序列设计合成9对特异性引物,以广西草龟基因组DNA为模板进行PCR扩增,所获得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序后,用Vector NTI Advance 10软件将各扩增序列拼接,获得草龟生长激素基因全序列,并用DNASTAR软件MegAlign程序中的Alignment Report和NCBI的BLAST对草龟GH基因全序列进行同源性比对分析及构建基于GH基因编码序列的物种间亲缘进化树.[结果]广西草龟GH基因全长8538 bp,与黄喉拟水龟GH基因全长8517 bp相比,二者的同源性高达98%,其中有118个碱基发生突变,插入37个碱基,14个位点发生碱基缺失;与鸡、鸭、鹌鹑、鸵鸟、红树林蛇的同源性分别为88%、83%、87%、86%和84%.[结论]GH基因编码序列具有较高的保守性.     

黄牛白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

为了克隆黄牛IL-2基因,采用RT-PCR技术,用ConA刺激12 h的黄牛颈部外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出黄牛IL-2基因,琼脂糖凝胶电泳技术显示扩增片段约为500 bp,分离纯化,将其克隆到PDM18-T载体,重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定以及核苷酸测序。结果显示,克隆的黄牛IL-2基因大小468 bp,与GenBank中报道的水牛、牛、绵羊、猫、马、鸡、犬、人、山羊、鼠、猪IL-2基因比较,同源性分别为98.9%;98.5%;97.0%;82.4%;79.9%;5.3%;78.2%;79.7%;95.9%;65.2%;84.7%。     

百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析

[目的]克隆百日草几丁质酶的基因片段,并对其序列进行分析.[方法]以百日草“梦境”系列为材料,提取其叶片总RNA,并根据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR克隆百日草几丁质酶基因片段（ZEchi）,并对该基因序列进行分析.[结果]克隆得到的片段长度为227 bp,共编码75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明,ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源性达70％以上,其中与葡萄的同源性最高,为74％;氨基酸同源性分析表明,该几丁质酶多肽属于18家族几丁质酶,且与已报道的其他植物几丁质酶氨基酸序列具有70％以上的相似性;氨基酸聚类分析表明,该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类;生物信息学分析表明,由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白,主要含α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构.[结论]该研究为进一步研究几丁质酶基因的功能奠定了基础.     

‘甘肃红豆草’肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

以‘甘肃红豆草’叶片总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出肌动蛋白(Actin)基因片段,并克隆到pMD18-T载体,阳性克隆经PCR鉴定后测序.结果表明:序列分析表明,该片段长258bp,编码86个氨基酸,所得序列与GenBank中注册的Actin基因核苷酸序列的相似性在88%以上,与其他肌动蛋白的氨基酸序列的相似性达92%以上.注册该基因到GenBank中,注册号为KP159623.采用半定量RT-PCR方法,分析Actin基因在甘肃红豆草不同组织器官中的表达量相对恒定,而编码花青素还原酶的BAN基因在器官间的表达量差异较大,表明其可作为研究其它重要功能基因在‘甘肃红豆草’中的表达和调控的内参基因.     

鸡传染性支气管炎病毒S2蛋白基因的克隆与序列分析

参考genebank已发表的IBV纤突蛋白S2基因序列,设计了两对特异性引物,对鸡传染性支气管炎病毒黑龙江肾型分离株Mg/Mk和K进行RT-PCR扩增,将扩增后得到的PCR产物克隆入pMD18-T载体,并进行测序和分析。结果显示:S2基因的核苷酸全长为1884bp,编码一条由628个氨基酸组成的多肽,与网上报道的相一致。地方分离株Mg株、Mk株、K株分别和标准株T株比较,其同源性分别为92.3%、94.7%和94.2%。而Mg和Mk株的同源性为97.2%,Mg和K株的同源性为96.7%,Mk和K株的同源性为99.5%。说明地方分离株的亲缘关系较近,而和T株的亲缘关系较远。     

小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与序列分析

目的：构建小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA重组表达质粒，以便深入进行CK2结构与功能的研究。方法：通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA，PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶。将NdeⅠ/HindⅢ彻底双酶切PCR产物定向连接到牛小肠碱性磷酸酶去5′端磷酸的同样彻底NdeⅠ/HindⅢ双酶切的表达载体pT7—7中，转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子，用0．8％琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化予，将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选两个阳性克隆进行DNA测序。结果：转化子的阳性筛选率为100％，限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质拉的大小与理论推测值相符。DNA测序结果表明：两个重组小鼠CK2β亚基克隆中的插入片段序列均与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异，但我们报道的这2个差异碱基与大鼠、兔、猪和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列一致。结论：本实验克隆的小鼠蛋白温酶CK2β亚基cDNA编码区序列可能是正确的序列。     

副结核分枝杆菌ISMav2基因的克隆与序列分析

以副结核分枝杆菌C-2染色体DNA为模板,以ISMav2基因特异性引物进行PCR扩增,获得约340 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMDTM18-T Vector中,通过α-互补法筛选、质粒PCR鉴定及序列分析鉴定,成功构建出重组质粒pMDTM18-T-ISMav2,为进一步研究ISMav2基因及其在副结核病诊断中的应用奠定了基础.     

一个新的水稻C2H2型锌指蛋白cDNA的克隆与序列分析

锌指蛋白 (ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎ)是一类具有“手指状”结构域的转录因子 ,负责调控基因的表达。锌指蛋白主要通过与核酸的相互作用 ,显示出不同的功能 ,如促进转录、抑制转录、单链ＤＮＡ结合、ＲＮＡ结合或ＲＮＡ/ＤＮＡ双向结合[1 ] 等。Ｃｙｓ2 /Ｈｉｓ2型锌指 (也称ＴＦⅢＡ型 )是真核生物的转录因子中结构描述的最为清楚的转录因子 ,其锌指区为ＣＸ2 - 4 ＣＸ3ＦＸ5ＬＸ2 ＨＸ3- 5Ｈ的结构[2 ] 。植物中目前已经克隆了一些Ｃ2Ｈ2型锌指蛋白基因 ,其中很多锌指区具有ＱＡＬＧＧＨ的保守区 ,如与拟南芥花发育相关的ＳＵ …     

猪细小病毒HN-2011株VP2基因的克隆及序列分析

根据GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)VP2基因序列设计引物,扩增HN-2011河南分离株的VP2基因片段,并将其克隆到pMD-18T载体中.序列分析结果表明,HN-2011分离株VP2基因长度为1 740 bp,编码580个氨基酸.利用MAGE 5.0软件绘制PPV系统发育进化树,结果显示,PPV毒株可以划分为4组,我国的PPV毒株主要集中在A和B两组,仅JY毒株位于C组;PPV VP2蛋白3维结构显示,氨基酸变异的多态性位点主要集中在病毒衣壳蛋白的表面.以上遗传进化关系表明,PPV HN-2011株是我国PPV的流行毒株.     

猪圆环病毒2型北京株全基因组的克隆与序列分析

为探索近年来北京地区猪圆环病毒2型（PCV2）的流行病学和变异规律,用PCR技术从北京不同猪场的临床发病猪和死亡猪病变组织中分别扩增和克隆获得4株PCV2分离株全基因组序列,并进行测定和分析。结果显示,4株PCV2基因组全长均为1767nt,其核苷酸同源性高达99％,与其他北京分离株的同源性也达98％以上,与国内外其他地区PCV2的核苷酸同源性也在95％以上。由此表明,各个PCV2分离株在进化方面存在地域相关性。     

鸽蛔虫ITS rDNA的克隆与序列分析

以采自广东省佛山市的鸽蛔虫(Ascaridia columbae)为研究对象,利用保守引物BD1和BD2扩增鸽蛔虫基因组DNA的ITS rDNA片段,对扩增产物进行克隆和序列测定。结果成功扩增出大小为1045bp的ITS rDNA序列。获得的鸽蛔虫的ITS rDNA序列(AC001、AC002)的5.8S rDNA与GenBank收录的鸡蛔虫5.8S rDNA序列(GenBank登录号为AJ001508)相似性分别为95.5%和94.3%,而与澳大利亚鸽蛔虫5.8 S rDNA序列(GenBank登录号为AJ001509)相似性分别为96.8%和95.5%。将获得的序列与蛔目不同科的代表性蛔虫的5.8SrDNA序列进行比对和系统进化分析,结果表明鸽蛔虫与鸡蛔虫处于同一进化分支上,也表明ITS rDNA是蛔虫分子鉴定的有效遗传标记,这对蛔虫分子分类学及分子流行病学的进一步研究打下了基础。     

根结线虫rDNA-ITS片段的克隆与序列分析

用PCR方法扩增了16个不同地区和不同作物上根结线虫群体的ITS片段,并进行了克隆、序列测定分析和比对。结果表明:采自北京密云苦瓜和豇豆、北京通州月季以及山东胶州、烟台、潍坊花生上的6个根结线虫群体为北方根结线虫(Meloidogyne hapla),其ITS片段大小为772 bp;来自云南番茄、成都黄瓜和海南石榴上的3个根结线虫群体为爪哇根结线虫(M.javanica),其ITS片段大小为767 bp;来自河北廊坊番茄、北京海淀番茄和浙江黄瓜上的3个根结线虫则属于花生根结线虫(M.arenaria),其ITS片段大小为768 bp;而安徽和县、宿州的番茄以及太和桔梗上的3个根结线虫则属于南方根结线虫(M.incognita),其ITS片段大小为766 bp;海南胡椒上的根结线虫群体为番禺根结线虫(M.panyuensis),ITS片段大小为869 bp。     

绵羊intelectin基因cDNA克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊intelectin基因;【方法】十二指肠粘膜组织提取总RNA,分别以上游电子克隆的拼接体和下游保守区为模板设计引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E.coli JM109,筛选阳性克隆并测序;【结果】克隆的绵羊intelectin基因与牛、猪、人、大鼠的同源性分别为93%、87%、83%、79%,预测的氨基酸序列包含FBG结构域。【结论】成功克隆了绵羊intelectin-2基因,并注册GenBank(Accession.EF624459)。     

猪2型钙蛋白酶抑制蛋白基因cDNA的克隆序列分析

钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin,CAST）是一种内源性的、需Ca2＋激活的钙蛋白酶抑制剂.本研究克隆了猪CAST基因的部分编码序列,并通过序列拼接首次获得了猪2型CAST基因的cDNA序列（Genbank acc.NO.AY555195）.通过对猪2型钙蛋白酶抑制蛋白进行结构预测及结构域分析,为进一步研究钙蛋白酶抑制蛋白在猪体内的功能打下了良好的基础.     

米曲霉磷酸果糖激酶基因克隆及序列分析

磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径的重要调控酶。以酿酒米曲霉CICC2012为材料,克隆获得PFK基因pfkA(GenBank登录号:KC113503.1)。序列分析表明:pfkA序列长度为2 722bp,含有2个内含子,开放阅读框长2 358bp;PFK为785个氨基酸组成的亲水蛋白,分子量86.0kDa,等电点6.38,含有2个PFK家族指纹结构;二级结构包含42.68%的α-螺旋,14.27%的β-折叠和43.06%的无规则卷曲;同源建模三级结构PFK含有N端和C端的2个结构域,底物果糖-6-磷酸结合于N端结构域。采用进化树分析,发现米曲霉PFK与丝状真菌PFK亲缘性较近。     

石斛属植物rDNA ITS序列的克隆与分析

对24种石斛属植物的rDNA ITS序列进行克隆分析,以期为石斛属植物的分子鉴定和遗传多样性研究提供依据。以叶片基因组为模板,利用通用引物分别扩增24种石斛属植物的ITS序列,结果表明,ITS全长为634～646 bp,其中,58S序列的长度十分保守,均为164 bp;而ITS1和ITS2序列长度变异较大,分别为226～235 bp和241～247 bp。ITS1和ITS2序列具有丰富的变异位点,分别为176和166个;其中,信息位点分别为114和104个,发现了大量的转换、颠换和插入/缺失现象。而58S序列相对保守,有36个变异位点,其中信息位点16个。本研究表明,利用ITS序列可将本研究中的24种石斛属植物完全区分,这24种石斛属植物的遗传距离为0007～0302,其中鼓槌石斛和粟斑鼓槌石斛的遗传距离最小,亲缘关系最为接近;而金耳石斛与短棒石斛的遗传距离最大,亲缘关系最远。     

绵羊Granulysin基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,设计1对克隆引物,从绵羊回肠黏膜组织中提取总RNA,进行RT-PCR,将PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E. coli JM109感受态细胞、检测阳性克隆、测序并进行序列分析.克隆的绵羊Granulysin基因与人、牛该基因的同源性分别为56.2%和87.2%,推导的氨基酸序列信号肽为1～22氨基酸,SapB结构域为64～138氨基酸,结构特征与人、牛的一致.结果提示,绵羊Granulysin基因克隆成功.     

蒙桑肌动蛋白基因的克隆与序列测定

为蒙桑基因表达与调控模式的研究以及蒙桑资源的利用提供参考,进行了蒙桑肌动蛋白(actin)基因的克隆与序列测定。结果表明:蒙桑actin基因mRNA序列大小为1 699bp,其中基因编码区1 134bp(GenBank登录号:KF031062),编码的377个氨基酸残基与其他植物的一致性在98%以上。该基因和川桑基因组中其他4个actin基因外显子数量和长度相同,但内含子差异极大,其CDS与桑树Morus010751(EXC30503)的一致性达到98%,氨基酸一致性为100%。聚类分析将其归为Class II类,与来自桑属和毛果杨的actin基因最先聚合在同一分支。