circADAMTS16的表达谱分析及其对牛脂肪细胞分化的影响

旨在探究 circADAMTS16在牛不同组织和前体脂肪细胞中的表达水平及其对牛脂肪细胞分化的影响,为进一步研究circRNA在细胞分化和脂肪组织发育过程中的调控作用提供依据。采用组织块法分离培养牛原代前体脂肪细胞并诱导分化,模拟牛脂肪组织生长发育过程;通过qRT-PCR检测 circADAMTS16在牛不同组织（心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪）和脂肪细胞分化不同阶段（0 d、2 d、4 d、8 d、10 d）的表达水平;构建 circADAMTS16的过表达载体（pCD2.1- circADAMTS16）,设计合成 circADAMTS16的小干扰RNA （si- circADAMTS16）,采用（Lipofectamine3000）转染试剂将pCD2.1- circADAMTS16和si- circADAMTS16转染牛前体脂肪细胞,利用qRT-PCR法检测转染效果,同时检测脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα和 C/EBPβ的表达量变化,并进行油红O染色,综合分析干扰和过表达 circADAMTS16对牛脂肪细胞分化的影响。结果如下：①qRT-PCR检测结果表明 circADAMTS16在心脏中表达量最高,肝脏次之,脾最低;②在牛原代前体脂肪细胞分化过程中, circADAMTS16在第2天显著高表达,随后逐渐降低,在第8天时达到最低。③在牛前体脂肪细胞中过表达circADAMTST16后,脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ的表达量显著下降;油红O染色结果显示,过表达后脂滴形成数量明显少于对照组;而干扰 circADAMTS16表达后,脂肪分化标志基因PPARγ和C/EBPα表达量显著上升。综上所述, circADAMTS16对牛原代前体脂肪细胞的分化过程具有显著的调控作用,过表达 circADAMTST16可抑制牛原代前体脂肪细胞分化进程,而干扰 circADAMTS16表达可以促进牛原代前体脂肪细胞分化进程,探明 circADAMTS16对牛原代前体脂肪细胞分化的具体调控作用。     

FOXO1基因调控牛前体脂肪细胞增殖和分化的功能研究

为探究干扰叉头转录因子O1（Forkhead box protein O1, FOXO1）对牛前体脂肪细胞增殖和分化的作用,本研究以固原黄牛的前体脂肪细胞为研究对象,采用组织块法分离牛前体脂肪细胞,并利用表型鉴定和标志基因表达谱2种方法鉴定所分离细胞的纯度和分化潜能。筛选并包装牛FOXO1干扰慢病毒,利用EdU染色、流式细胞术、油红O染色和qPCR方法探究干扰FOXO1对牛脂肪细胞增殖和分化的作用。结果表明：1）成功分离了牛前体脂肪细胞,且其具有较高的纯度和分化潜能。2）EdU染色结果表示,侵染Lv-FOXO1极显著增加了牛脂肪细胞的增殖率（P<0.01）。3）流式周期结果显示,干扰FOXO1显著增加了牛脂肪细胞S期阳性细胞的比例,促进了G1/S期的转化,进而促进了牛脂肪细胞增殖。4）干扰FOXO1后,增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达量均极显著上调（P<0.01）。5）干扰FOXO1后牛前体脂肪细胞脂滴生成明显减少,且成脂标志基因PPARG的表达极显著下调（P<0.01）,CEBPB和LPL的表达显著下调（P<0.05）。综上,干扰FOXO1可通过上调增殖标志基因PCNA、CDK1和CDK2的表达促进牛脂肪细胞G1/S期的转化,进而促进牛脂肪细胞增殖,且其可通过降低成脂标志基因PPARG、CEBPB和LPL的表达减少牛脂肪细胞脂滴形成,进而影响脂肪沉积。本研究可为中国地方黄牛的肉质遗传改良提供理论依据。     

胰岛素诱导牛成肌细胞成脂分化的研究

【目的】建立稳定成熟的牛成肌细胞胰岛素诱导成脂分化体系,为肉牛肉脂品质的改良提供参考。【方法】取1日龄荷斯坦公牛犊后腿肌肉,用Ⅳ型胶原酶消化法分离成肌细胞,用胰岛素诱导成肌细胞成脂分化,以未添加胰岛素的培养基为对照组,检测成肌细胞成脂分化过程中细胞形态的变化,并分析与成肌细胞和脂肪细胞分化相关基因(C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ、Myf5、MyoD)分别诱导第3,6,9,12,15天相对表达量的变化,分析牛成肌细胞的诱导分化情况。【结果】成功分离培养了牛原代成肌细胞。胰岛素处理组细胞中脂滴的油红O染色明显,C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ和MyoD相对表达量明显增高,C/EBPα和Myf5基因相对表达量则下降;用DMEM高糖培养基+体积分数10%胎牛血清(FBS)培养时,C/EBPs基因相对表达量总体高于DMEM高糖培养基+体积分数20%FBS+体积分数10%马血清(HS)。【结论】成功分离并鉴定了牛成肌细胞,建立了适于牛成肌细胞的体外培养体系,用胰岛素诱导成肌细胞成脂分化效果好。     

秦川牛PLIN2基因参与脂滴形成调节机制的研究

【目的】研究PLIN2基因对秦川牛脂肪细胞分化过程中脂滴形成的功能。【方法】以秦川牛原代脂肪细胞为试验材料,采用高干扰效率的si-PLIN2及对照组si-NC,超表达PLIN2基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-PLIN2及对照pcDNA3.1(+)-empty vector（pcDNA3.1(+)-EV）,转染秦川牛脂肪细胞并进行相关基因mRNA及蛋白水平表达量验证,并对转录因子C/EBPα是否能结合在PLIN2基因启动子区域进行验证。【结果】si-PLIN2处理组中CREB基因表达量无明显变化,C/EBPβ和C/EBPα基因mRNA水平表达量与si-NC对照组相比分别出现显著或极显著下调。与对照组pcDNA3.1(+)-EV相比,过表达组pcDNA3.1(+)-PLIN2CREB相对表达量极显著上调,C/EBPα和C/EBPβ基因相对表达量上调,但差异不显著。Western blot蛋白表达水平检测发现,si-PLIN2中磷酸化水平CREB(phospho-CREB,p-CREB)、C/EBPβ、C/EBPα的表达量显著低于对照组si-NC,过表达组上述转录因子表达量未出现明显上调。ChIP试验结果表明,转录因子C/EBPα可以结合在PLIN2基因启动子区域,并调控秦川牛PLIN2基因的表达。【结论】下调秦川牛PLIN2基因可反馈抑制上游cAMP-PKA信号通路p-CREB、C/EBPβ、C/EBPα 3个转录因子的表达,从而抑制秦川牛脂肪细胞分化过程中脂滴生成。     

猪CHPT1基因的发现及其表达谱分析

【目的】对猪脂肪组织RNA的Solexa测序结果进行分析整理,发现猪新转录本CHPT1基因。研究CHPT1在猪不同组织及脂肪细胞不同分化阶段的表达谱,以便为后续的基因功能研究奠定基础。【方法】取猪的背部脂肪组织提取RNA,建立cDNA文库,进行Solexa测序,对测序结果进行生物信息学分析。利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及实时荧光定量PCR,克隆猪CHPT1基因的CDs区部分序列,并对其在不同组织及脂肪细胞不同分化阶段的表达谱进行分析。【结果】由Solexa测序分析结果发现,猪存在新转录本基因CHPT1,其对应的Tag表达量在180日龄大白猪与240日龄荣昌猪的脂肪组织中无明显差异,在3日龄与240日龄荣昌猪脂肪组织中表达差异达到20倍以上。克隆获得了其CDs区193 bp的cDNA序列。实时荧光定量PCR检测结果表明,CHPT1基因在3日龄和180日龄大白猪的各个组织中均有表达,其中在肝脏和肾脏中表达量较高,且表达量有差异。3日龄与180日龄大白猪相比,肾脏和脂肪组织中CHPT1的表达量均有显著差异。在猪前体脂肪细胞的时序表达结果中,CHPT1表达量呈先增加后降低的趋势,其中第2天表达量明显升高,于第6天达到最大值,之后降低。【结论】猪存在CHPT1基因,其在猪的各个组织中都有表达,对猪的脂肪沉积可能发挥着重要作用。     

松辽黑猪前体脂肪细胞分离及诱导分化

为建立松辽黑猪前体脂肪细胞分化体系,了解其增殖规律及相关的脂肪标志基因在细胞分化过程中的相对表达。选用7日龄松辽黑猪,用Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织得到前体脂肪细胞,传代后进行形态学观察并绘制生长曲线,利用传统"鸡尾酒"法进行诱导分化,油红O对分化后的细胞进行染色,判断分化效果,提取总RNA,对成脂标志基因进行相对表达量分析。结果表明:分离获得的松辽黑猪原代前体脂肪细胞可贴壁生长,形似成纤维细胞,细胞生长曲线符合细胞生长规律,近似"S"形;诱导分化后的细胞具有成熟脂肪细胞的典型特征,细胞内聚集大量脂滴;诱导后第10天,细胞内甘油三酯含量极显著提高;成脂标志基因PPARγ、C/EBPα在分化后的细胞中相对表达量极显著升高(P<0.01),而FoxO1在分化前相对表达量最高,第5天表达量与第0天相比极显著下降(P<0.01),但第10天的表达量极显著高于第5天(P<0.01),且第10天表达量与第0天无显著差异(P>0.05)。试验建立了松辽黑猪前体脂肪细胞的分离体系,为进一步研究松辽黑猪脂肪沉积与代谢机制以及改善肉质提供了依据。     

麦洼牦牛 Hoxa10基因克隆、原核表达及组织表达谱

从麦洼牦牛肾脏组织提取总RNA,以已公布牛 Hoxa10编码区序列设计引物,RT PCR法克隆麦洼牦牛 Hoxa10基因;构建原核表达载体pET 32a(+) Hoxa10,并在大肠杆菌表达系统中表达,SDS PAGE检测融合蛋白;采用RT PCR检测该基因在麦洼牦牛各组织中的表达分布。结果表明：从麦洼牦牛肾脏中克隆 Hoxa10基因的CDs区,大小为285 bp,编码94个氨基酸残基,与牛、猪和绵羊的 Hoxa10同源性高;经IPTG诱导,pET 32a(+) Hoxa10在BL21中可表达1个大小约为28 ku的特异蛋白;在牦牛各组织中,肾脏和肺脏中表达较高,但在心脏表达量极低或不表达。     

牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的克隆及序列分析

为了解牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因的特点,根据GenBank已公布的牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因序列设计4对引物,每个基因分两段扩增,测序并拼接,首次克隆牦牛应激型 HSPA1A和 HSPA2基因。序列分析表明,扩增到的牦牛应激型 HSPA1A基因全长2 134 bp,开放阅读框全长1 926 bp,编码641个氨基酸,分子质量为70.26 ku; HSPA2基因全长1 911 bp,开放阅读框全长1 911 bp,编码636个氨基酸,分子质量为69.85 ku。将 HSPA1A和 HSPA2基因开放阅读框编码的氨基酸序列进行ScanProsite分析,均得到3个HSP70蛋白家族标记。核苷酸序列同源性分析表明, HSPA1A和 HSPA2基因具有较高的保守性,牦牛与牛的 HSPA1A和 HSPA2基因核苷酸序列同源性最高,分别为99.8%和99.1%。遗传进化关系分析表明,牦牛与牛的应激型 HSPA1A和 HSPA2基因亲缘关系最近。     

猪ACSM3基因过表达/敲减质粒的构建

脂肪主要由甘油和脂肪酸组成，酰基辅酶A合成酶中链家族成员3（Acyl-CoA medium-chain synthetase 3，ACSM3）是脂肪酸代谢第一步反应中的关键酶。为了深入研究ACSM3基因的生物学功能，采用克隆、测序、双酶切、连接等分子生物学技术，将ACSM3基因的完整编码区连入pcDNA3.1(+)载体内，构建该基因的过表达质粒；通过生物合成技术，构建该基因的敲减质粒。然后利用体外培养的猪前体脂肪细胞，检测ACSM3基因的过表达/敲减质粒的作用效果。结果表明，成功构建了ACSM3基因的过表达质粒，该质粒的过表达效果可一直持续到转染后的第8天。从3条特异性干扰序列中筛选出1条具有显著敲减效果的序列，敲减作用可持续到转染后的第2天。本研究所构建的过表达/敲减质粒，可为后续的ACSM3基因的功能研究提供有力的技术支持。