铁皮石斛基因克隆的研究进展

铁皮石斛是我国传统名贵珍稀中药材,其重要性状的基因克隆对培育铁皮石斛新品种具有很强的实用价值。为铁皮石斛功能基因组的研究提供参考,从与有效成分合成相关的基因克隆、生长发育相关的基因克隆及抗逆相关的基因克隆等方面进行综述。     

铁皮石斛基因克隆的研究进展

铁皮石斛是我国传统名贵珍稀中药材,其重要性状的基因克隆对培育铁皮石斛新品种具有很强的实用价值。为铁皮石斛功能基因组的研究提供参考,从与有效成分合成相关的基因克隆、生长发育相关的基因克隆及抗逆相关的基因克隆等方面进行综述。     

铁皮石斛豆腐柴螺二烯加氧酶基因克隆与表达分析

[目的]克隆铁皮石斛(Dendrobium officinale)豆腐柴螺二烯加氧酶(premnaspirodiene oxygenase,PO)基因,分析该基因在铁皮石斛开花期不同器官及营养生长期叶片中的表达模式,以期为进一步鉴定基因功能及探讨铁皮石斛植保素的生物合成及抗病机制奠定基础.[方法]利用RT-PCR和RA...     

铁皮石斛DcbHLH14基因克隆及表达分析

【目的】克隆铁皮石斛转录因子DcbHLH14基因并分析其在非生物胁迫响应中的表达情况,为研究DcbHLH14基因的功能提供理论参考。【方法】通过同源克隆从铁皮石斛叶组织中得到DcbHLH14基因,对其编码的蛋白序列特征和组织表达特性进行分析,并采用qRT-PCR对DcbHLH14基因在低温、干旱和ABA处理过程中的表达量进行分析。【结果】DcbHLH14基因开放阅读框(Open reading frame, ORF)为1 269 bp,与参考序列存在7个碱基差异,仅含有1个外显子且无内含子,编码422个氨基酸。DcbHLH14蛋白的分子式为C₂₀₁₁H₃₁₉₂N₅₈₆O₆₁₃S₁₃,理论分子量为45.8 kD,理论等电点(pI)为5.98,含有bHLH家族保守结构域bHLH-MYC-N和HLH,属于bHLH家族,与鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum)和春兰(Cymbidium goeringii)bHLH蛋白的氨基酸序列同源性较高,分别为97.16%和86....     

铁皮石斛2个P型H~+-ATPase基因的克隆、表达及生物信息学分析

利用RACE进行铁皮石斛质膜PMA(plasma membrane H~+-ATPase)基因的全长克隆,采用生物信息学方法、DNASTAR 7.0和MEGA 7.0对其编码蛋白结构、序列和分子进化等进行分析,并借助实时荧光定量PCR技术检测基因表达模式。结果表明,从铁皮石斛叶片cDNA中分离到2个P型H~+-ATPase基因 DoPMA1和 DoPMA2(GenBank注册号KU160470和KU160471),各编码1条由973和951个氨基酸组成的肽链;2个基因编码蛋白均含有2个保守的P型ATPase结构域和5个H~+运输ATPase结合位点,不含信号肽,定位在质膜。2个蛋白与植物H~+-ATPases蛋白相似性大于72%,聚在拟南芥、水稻等植物H~+-ATPase分子进化树的Ⅴ和Ⅱ分支。实时荧光定量PCR分析表明, DoPMA1在根和茎中上调,分别为叶中的2.98、1.95倍, DoPMA2在根与叶中表达无显著差异,茎中下调为叶中的0.86倍。研究结果为进一步揭示 DoPMA1和 DoPMA2分子作用奠定基础。     

黄瓜RNA解旋酶基因家族的生物信息学鉴定和表达分析

利用生物信息学方法对黄瓜RNA解旋酶基因家族成员、基因分类、染色体定位和系统进化关系进行了分析预测,并利用实时荧光定量PCR技术检测了11个黄瓜DEAD-box RNA解旋酶基因的组织表达模式和NaCl、低温4℃、脱落酸(ABA)以及高温39℃胁迫条件下的表达变化。结果表明,黄瓜RNA解旋酶家族包含101个基因,DEAD-box、DEAH-box和DExD/H-box 3个亚家族分别包含32、27和42个基因成员;黄瓜的7条染色体均有RNA解旋酶基因分布,其中第3条染色体最多,有30个RNA解旋酶基因,仅有8个基因分布在第4条染色体上;黄瓜RNA解旋酶基因编码的蛋白包含376~2 330个氨基酸,等电点在5.13~10.00;qRT-PCR分析发现,除CsDEAD16和CsDEAD25外,其他基因在花中表达量均最高,在黄瓜根中仅检测到CsDEAD17、CsDEAD21、CsDEAD22和CsDEAD24的表达;黄瓜幼苗经上述胁迫处理后11个基因均有不同程度的表达量变化,其中CsDEAD16、CsDEAD21、CsDEAD22、CsDEAD24、CsDEAD25和CsDEAD27明显受ABA上调,而CsDEAD24的表达受高温诱导。本研究为进一步探索黄瓜RNA解旋酶基因在其生长发育中的作用和抗性作用机制,奠定了一定的理论基础。     

铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛Dendrobium officinale可溶性酸性转化酶基因SAI,分析该基因生物学信息及时空表达特异性。【方法】基于同源序列克隆铁皮石斛SAI基因c DNA全长,采用生物信息学方法进行序列分析,并采用qRTPCR进行组织特异性表达分析。【结果】铁皮石斛SAI基因全长为1 595 bp,c DNA编码区1 368 bp,Genbank登录号为KU598852。该基因编码455个氨基酸,蛋白相对分子质量为50 700。NCBI BLASTx分析表明,该基因氨基酸序列与柑橘Citrus unshiu酸性转化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高,达77%,与其他植物酸性转化酶基因的相似性均高于68%。聚类分析表明,铁皮石斛SAI基因与玉米Zea mays液泡转化酶基因、甘蔗Saccharum officinarum SAI基因亲缘关系最近。该基因编码的蛋白质属于非跨膜结构的亲水性热稳定蛋白,定位于液泡中。SAI基因在2年生铁皮石斛的茎中表达量最高,3年生的叶中表达量最低。【结论】成功克隆铁皮石斛液泡酸性转化酶基因,该基因在铁皮石斛不同组织不同生育时期的表达量差异较大。     

铁皮石斛糖苷水解酶GH3基因家族鉴定及表达模式分析

利用生物信息学方法对铁皮石斛GH3基因家族成员进行筛选、鉴定,对其基因结构、蛋白理化性质、亚细胞定位、系统进化、蛋白质二级结构及跨膜预测、基序及染色体定位进行分析,同时分析GH3基因家族在不同组织以及低磷与正常磷水平下的表达模式。在铁皮石斛全基因组中筛选得到13个GH3家族基因,其中一个基因存在可变剪切,表达为14个GH3蛋白。GH3基因家族蛋白可分为3个亚家族,各亚家族中不同基因相对保守;各成员均含有内含子与外显子,内含子相位在0～2,13个基因分布在8染色体上。GH3基因家族在铁皮石斛的8个组织中均有表达,其中白根和花蕾表达量高,茎和唇瓣低,推测GH3基因家族可能参与铁皮石斛根系生长以及开花现蕾。低磷与正常磷水平表达结果表明,低磷水平下叶中基因LOC110110392、LOC110100144表达上调,根中基因LOC110095762、LOC110107269表达上调。该研究对铁皮石斛糖苷水解酶GH3基因家族成员生物信息学、在不同组织以及正常磷与低磷条件下的表达水平进行研究分析,筛选响应低磷信号的糖苷水解酶基因,为后期研究糖苷水解酶参与低磷条件下铁皮石斛多糖代谢调节机制提供研究基础...     

两种铁皮石斛总RNA提取方法的比较研究

 铁皮石斛是我国重点保护药材,因其富含多糖及次生代谢物,用普通的方法难以从叶中提取到能满足构建全长cDNA文库等分子生物学实验对高质量RNA需要的总RNA。分别通过对异硫氰酸胍法和CTAB法进行改良。异硫氰酸胍法：往裂解液中加入PVP,通过PVP去除多酚;用56℃热水水浴5min加速组织细胞裂解;抽提时间由原来15 min缩短为5min;根据材料多糖多酚的多寡情况适当增加裂解液。CTAB法：根据材料多糖多酚的多寡情况适当增加CTAB裂解液;用LiCl对RNA进行选择性过夜沉淀;灵活处理,适当增大LiCl浓度。结果表明用改良后的2种方法均可提取到总RNA,经对比发现,改良CTAB法提取效果更好,可重复性强,抽取到的RNA更适合于后续的分子生物学实验。     

铁皮石斛转录组微卫星序列统计分析

为揭示铁皮石斛全基因组SSRs序列分布规律,采用微卫星序列搜索和统计软件MSDB v2.4对铁皮石斛全基因组中完整型微卫星序列及其特征进行生物信息学分析。结果表明:铁皮石斛微卫星序列总数量为215 661个位点,微卫星序列长度为4.07 Mb,占全基因组总长度的比率为0.44%,其总丰度为213.84个·Mb^-1,总密度为4 031.927 bp·Mb^-1。铁皮石斛全基因组SSRs各重复类型中,单核苷酸SSRs序列出现频率最高(47.49%),其次是二核苷酸SSRs序列>三核苷酸SSRs序列>四核苷酸SSRs序列>五核苷酸SSRs序列>六核苷酸SSRs序列,微卫星重复类型中,富含A和T,而富含G和C碱基的微卫星出现频率较少。研究结果可为后续铁皮石斛遗传多样性的研究及SSR引物筛选提供依据。     

铁皮石斛鲨烯合酶基因的克隆及其组织表达模式分析

【目的】克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)鲨烯合酶(Squalene synthase,SS)基因(DoSS),并对其进行生物信息学与组织表达模式分析,为研究其生物学功能提供参考。【方法】采用RT-PCR和RACE技术,获得DoSS基因全长序列;利用生物信息学软件预测DoSS蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行DoSS蛋白氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助qPCR检测DoSS基因的组织表达模式。【结果】成功克隆获得铁皮石斛鲨烯合酶基因,命名为DoSS(GenBank注册号JX272631),其cDNA全长1 735bp,编码一条由410个氨基酸组成的多肽,分子质量46.99ku,等电点7.13;DoSS蛋白含有鲨烯/八氢番茄红素合成酶保守结构域(44-315位氨基酸);DoSS与其他多种植物SS基因的编码蛋白同源性很高(61%~75%),与水稻、玉米等单子叶植物的亲缘关系较近;DoSS基因为组成型表达,在根中的表达量最大,为叶的12.41倍;茎次之,为叶的1.87倍。【结论】成功克隆得到1个鲨烯合酶基因(DoSS)全长cDNA;DoSS基因的(在根中高)表达特征暗示,其可能在铁皮石斛根的生长发育中发挥重要的调控功能。     

铁皮石斛RRT家族全基因组鉴定及表达分析

多糖是药用植物铁皮石斛(Dendrobium officinale)的主要成分之一。鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ鼠李糖转移酶(rhamnogalacturonⅠrhamnosyltransferase, RRT)在Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖的合成中起重要作用。利用生物信息学在全基因组水平鉴定出4个铁皮石斛RRT家族基因( DoRRT1、 DoRRT2、 DoRRT3、 DoRRT4),通过逆转录定量PCR检测该基因家族在不同组织和胁迫下的表达情况。结果表明：在系统发育上DoRRT1、DoRRT3被聚为一组,DoRRT2、DoRRT4被聚为一组;DoRRT蛋白均为亲水蛋白质,可定位于高尔基体;DoRRT蛋白的α-螺旋和无规卷曲较多;4个DoRRT蛋白均有O-FucT保守结构域;组织表达显示 DoRRT1、 DoRRT2、 DoRRT4在根、茎、叶中均有表达,且在地上部的转录水平较高;胁迫表达表明 DoRRT2、 DoRRT4在高温胁迫下表达显著下调, DoRRT2在PEG模拟干旱条件下表达显著下调,说明 DoRRT2、 DoRRT4参与非生物胁迫响应。以上结果为深入研究DoRRT的生物学功能提供数据...     

遮阴对铁皮石斛生长与品质的影响

为了明确铁皮石斛农艺性状和糖类成分之间的相互关系,为铁皮石斛种植和新品种选育提供理论依据,探讨了遮阴对铁皮石斛农艺性状与糖类成分积累的影响,测定遮阴条件下铁皮石斛农艺性状和糖类成分的变化情况,并对农艺性状与糖类成分进行相关性分析、多元回归分析和通径分析。结果表明：遮阴组的叶长、叶宽、纤维素、半纤维素显著小于对照组,而茎粗、生物量、可溶性多糖含量、甘露糖含量、甘露糖/葡萄糖值显著大于对照组;对生物量负向影响最大的是叶数（-0.840）;对可溶性多糖含量正向影响最大的是茎长（0.864）;对甘露糖/葡萄糖值负向作用最大的是茎长（-1.230）,其次是茎粗（-0.427）。可见遮阴处理能显著提高铁皮石斛甘露糖含量以及甘露糖/葡萄糖值,减少粗纤维的积累,从而促进了石斛茎粗的生长和生物量的积累。因此,可将遮阴处理适时应用于铁皮石斛人工种植中,生产中也可以通过控制茎长、茎粗等性状指标来筛选高品质、高产量的铁皮石斛品种。     

铁皮石斛miR168分子进化特征及响应蓝激光表达分析

笔者在关于铁皮石斛miRNA组学研究中发现较多响应蓝激光的miRNA,挑选关键且差异表达的miR168进行分子进化特征及其响应蓝激光表达分析。经对前体和成熟体分类统计、进化树构建、靶基因预测、启动子顺示作用元件及响应不同光质表达等进行分析,结果显示：miR168家族成员分布在40个植物物种中,前体和成熟体成员较少,其在植物中可能进化得不够完整;物种特异性是影响miR168前体进化特性的重要因素,而序列保守性是影响成熟体进化特性的主要因素;由3p臂上形成的miR168成熟体序列有较高特异性、5p臂形成的成熟体的序列保守性较高;Mfold和Rfam预测表明铁皮石斛miR168茎序列的保守性高于环序列,前体发卡结构较多,成熟体位置位于3p臂上,既包含茎序列也包含环序列;铁皮石斛miR168a的启动子主要包括光、激素、生物和非生物胁迫响应元件,可能通过这些顺式元件在其响应蓝激光中起调控作用;铁皮石斛响应蓝激光的靶基因主要包括ABC转运蛋白B家族成员、乙酰辅酶 A 乙酰转移酶等,主要参与植物生长发育和响应外界因素。实时荧光定量PCR结果表明,铁皮石斛miR168a与其靶基因gene-MA16_Dca006149、gene-MA16_Dca020995、gene-MA16_Dca017821参与蓝激光对铁皮石斛的影响。     

铁皮石斛多糖的提取工艺优化及其抗氧化活性研究

【目的】优化铁皮石斛多糖的提取工艺,并评价铁皮石斛多糖的抗氧化活性。【方法】以铁皮石斛多糖提取率为响应值,在单因素试验基础上,以提取时间、提取次数及液(mL)料(g)比为试验因素,采用响应面法建立数学模型,筛选最佳提取工艺条件。采用自由基清除能力体系初步评价铁皮石斛多糖的抗氧化活性。【结果】通过二次回归模型响应面分析,获得最佳的铁皮石斛多糖提取工艺为:提取次数3次、提取时间2h、液(mL)料(g)比75。在此最佳工艺条件下,铁皮石斛多糖提取率为34.96%,与理论值(36.57%)相对误差小于5%。铁皮石斛多糖对DPPH和ABTS自由基的半数清除率分别为1.20和3.65mg/mL。【结论】采用响应面法优化得到了铁皮石斛多糖的最佳提取工艺,该工艺方便可行,得到的多糖具有较强的抗氧化活性。     

霍山石斛生物碱的提取及铁皮石斛的鉴别

采用超声波辅助酶法提取霍山石斛中的生物碱，通过对固液比、超声时间、超声功率、酶解时间、复合酶（纤维素酶和果胶酶1∶1等活力混合）质量分数的单因素试验和正交试验，确定提取最佳的条件；通过气相色谱-质谱法对霍山石斛中生物碱的组成成分进行分析；通过傅里叶变换红外光谱及二阶导数变换谱图快速鉴定霍山石斛和铁皮石斛。结果表明，当固液比为1:40（g·mL^-1），超声时间为20 min，超声波功率为200 W，复合酶（纤维素酶和果胶酶1∶1等活力混合）添加量1.5%，酶解时间1.5 h为提取条件时，提取效率最佳，生物碱得率为0.053%。根据气相色谱-质谱法检测结果可得知，相对于铁皮石斛，霍山石斛的石斛碱和6-羟基石斛次碱为其特殊生物碱。二阶导数变换谱图可更直观地通过二者峰形状、个数和强度的不同来区分。因此，可以将气相色谱质谱联用和傅里叶红外光谱结合在一起来高效鉴定霍山石斛与铁皮石斛。     

青稞HbTsi1的克隆及其序列特征与表达特性分析

为了探究DREB类基因在青稞干旱胁迫下的表达模式,通过RT-PCR技术从抗旱品种‘喜马拉雅10号’中克隆其中的一个基因全长cDNA,并利用Real Time PCR方法研究其在干旱胁迫、复水条件下的表达情况。结果表明:从抗旱材料中克隆一个1 237bp全长cDNA序列,命名为HbTsi1(登录号:KJ699390)。生物信息学分析表明,该序列开放阅读框长为837bp,编码278个氨基酸序列,由HbTsi1的ORF推测所编码的蛋白,预测分子质量为30.33ku,等电点(pI)为6.11。Prosite Scan分析结果表明,该基因含有AP2/ERF domain profile家族特征基序、1个Bipartite nuclear localization signal profile、6个蛋白激酶C磷酸化位点、6个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、5个N-豆蔻酰化位点、2个cAMP和cGMP依赖性的蛋白激酶磷酸化位点、2个氮糖基化位点。TMHMM预测该蛋白不含跨膜转移功能区。Signal IP3.0预测该蛋白没有信号肽,不属于分泌蛋白。PSORT亚细胞定位预测该基因所编码蛋白位于细胞质。推导的氨基酸序列同源比对分析结果表明,HbTsi1蛋白与短芒大麦的DREB蛋白具有较高的相似性。利用实时定量PCR方法研究HbTsi1在干旱胁迫条件下及复水后不同时间点的表达情况,发现HbTsi1在土壤绝对含水量为33.4%时表达量最高,随着土壤绝对含水量的下降而下调表达;当达到作物正常生长所需的土壤绝对含水量时又开始上调表达;进行干旱胁迫后(15.5%)基因表达量下降;复水后8h时恢复至最高表达水平。说明,HbTsi1基因可能是青稞抗旱节水的关键基因。     

不同生长条件下铁皮石斛内生细菌多样性及活性菌株的筛选

目的 比较和分析野生与人工栽培铁皮石斛Dendrobium officinale 内生细菌分布特点,筛选有较强定殖能力的活性菌株,为促进野生铁皮石斛驯化、提高药材品质奠定基础。方法 采用组织块分离法分离铁皮石斛根、茎、叶各部位的内生细菌,利用16S rDNA序列和系统发育树对分离菌株进行分析鉴定,体外筛选具有解磷、解钾、固氮、产铁载体、产IAA、拮抗病原菌的促生活性菌株,回接后再分离,观察内生细菌在组培苗中的定殖动态。结果 从铁皮石斛中分离到285株内生细菌,其中,217株分离自野生铁皮石斛,归类于3门9属,以芽孢杆菌属Bacillus和不动杆菌属Acinetobacter为优势菌群存在于根、茎、叶中,其菌株数分别占总分离菌株数的79.26%和8.76%;68株内生细菌分离自人工栽培铁皮石斛,归类于1门3属,以伯克霍尔德菌属Burkholderia和埃希菌属Escherichia为优势菌群存在于根、茎中,其菌株数分别占总分离菌株数的54.41%和30.88%。泛菌属Pantoea在野生和人工栽培铁皮石斛中均有分布。野生铁皮石斛内生细菌的物种数(9)和多样性指数(0.85)明显高于人工栽培铁皮石斛(物种数为3,多样性指数为0.61)。活性筛选共获得38株菌株,占筛选菌株的45%,4株野生铁皮石斛的活性内生细菌中有3株在人工组培苗具有较好的定殖性。结论 野生与人工栽培铁皮石斛内生细菌的类群结构和生物多样性具有明显差异,铁皮石斛内生细菌蕴含丰富的促生潜力。