通过根癌农杆菌介导法获得新疆甜瓜抗病优质新品系

用新疆甜瓜无菌苗子叶块,通过根癌农杆菌介导法,将黄瓜花叶病毒外壳蛋白ｃＤＮＡ基因导入“新红心脆”等６个品种（系）,经卡那霉素筛选,获得大量Ｋｍ抗性植株,其中部分Ｋｍ抗性植株经Ｌｕｉｓ法检测,表达了胭脂碱合成酶活性。进一步经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ＤＯＴ－Ｅｌｉｓａ,ＰＣＲ特异扩增。Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ等方法检测,结果证明了Ｋｍ抗性植株基因组中整合了ＣＭＶ－ＣＰ基因,长度为１ｋｂ,并能有效表达,表达产     

番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究

在ＴＭＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的５′和３′端分别合成寡聚核苷酸引物Ｐ１和Ｐ２，并分别引入ＣｌａＩ和ＢａｍＨＩ位点，采用ＰＣＲ技术扩增ＴＭＶＣＰ基因，用ＣｌａＩＢａｍＨＩ消化后重组到ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中，并将该基因与ＣＭＶＣＰ基因重组在同一个表达载体ｐＥ３上获得双价ＣＰ基因表达载体ｐＥＴＣ２，转化番茄，获得再生植株。通过点杂交、ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实２、１２和１３号为转ＴＭＶ和ＣＭＶＣＰ基因的工程植株。工程植株在温室中表现正常，比对照植株表现出明显的抗性。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

本文报道采用反转录酶—聚合酶链式反应，体外扩增芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）外壳蛋白基因及其克隆，并在大肠杆菌中获得表达的结果；从抗州市郊区感病的油菜上分离到一株致病力极强的芜菁花叶病毒分离物，提纯后，经５０ｎｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ和０．５％ＳＤＳ处理，苯酚／氯仿和氯仿抽提两次，酒精沉淀，获得了纯化的病毒ＲＮＡ，该ＲＮＡ与ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）＿（１５）退火后，在ＡＭＶ反转录酶的作用下合成了单链ｃＤＮＡ，然后加入用以扩增ＴｕＭＶ－ＣＰ基因的上下游引物，３５个循环后，得到了一条长约０．８５ｋｂ的片段，将该片段克隆到ｐＵＣ１８质粒的ＳａｌⅠ限制性酶切位点，分析了限制性酶切图谱，分析表明该片段含有ＥｃｏＲⅠ和ＸｂａⅠ以及引物设计时带人的ＭｃｏⅠ三个酶切位点，该片段克隆到大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）原核表达载体ｐＫＫ２３３－２质粒的ＮｃｏⅠ和ＨｉｎｄⅡ位点后，经ＩＰＴＧ诱导，以该病毒的抗血清为第一抗体，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测该基因的表达产物，结果表明该基因的表达产物为ＴｕＭＶ－ＣＰ蛋白，因而认为所获得的扩增片段确为芜菁花叶病毒外壳蛋白基因。     

TMV蚕豆株系CP基因及3′端非编码区序列分析与表达

根据烟草花叶病毒Ｕ１株系ＴＭＶ－Ｕ１序列，人工合成引物，通过ＰＣＲ扩增并克隆了烟草花叶病毒蚕豆株系（ＴＭＶ－Ｂ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和３′端非编码区．ＤＮＡ全序列测定结果表明，外壳蛋白基因全长４５９个碱基，编码１５１个氨基酸，３′端非编码区全长２２４个碱基．与ＴＭＶ－Ｕ１株系相比，ＴＭＶ－Ｂ仅在ＣＰ基因上有一个碱基缺失，并导致ＣＰ基因提前终止，使其编码的氨基酸少７个．将ＣＰ基因及３′端非编码区插入ｐＧＥＭＥＸ－１的Ｔ７基因１０中，转入Ｅ．ｃｏｌｉ后诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈现一特异的蛋白带．Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫检测证明，该特异带与ＴＭＶ抗血清呈阳性反应．将ＣＰ基因正向插入植物表达载体ＰＢⅠ１２１中，置于花椰菜花叶病毒３５Ｓ启动子控制之下，获得了植物表达载体ｐＺＬ５     

大麦黄矮病毒GAV株系通读蛋白基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以大麦黄矮病毒（ＢＹＤＶ）ＧＡＶ为模板,通过ＲＴ－ＰＣＲ护增获得通读蛋白（readthrough protein RTP)基因的目的版段,将其重组到pGEM-7zf( )并转化ＪＭ１０９利到了含有完整ＲＴＰ基因的重组子,采用又脱氧终上法进行序列分析。结果表明,ＲＴＰ基因为１３３７nt,与文献报道的血清学较密切的ＢＹＤＶ ＭＡＶ－ＰＳ１相比,核苷酸和氨其酸的同源性分别为８７．４％和８７．１％。将些ＲＴＰ基因克隆到原核表达质粒pET-5a上,在大肠植菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中用ＩＰＴＧ旅导表达,利用 分离包含体的方法结合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳,利到了纯化的分子是为６６ku的非融合蛋白。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）M和N蛋白基因扩增与克隆

猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）Ｍ和Ｎ蛋白基因扩增与克隆蔡家利姜平简中友马志勇蔡宝祥（南京农业大学畜禽传染病研究室，南京２１００９５）ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮＡＮＤＣＬＯＮＩＮＧＯＦＭＡＮＤＮＰＲＯＴＥＩＮＧＥＮＥＯＦＰＯＲＣＩＮＥＲＥＰＲＯ...     

应用A蛋白夹心酶联免疫吸附法鉴定黄瓜花叶病毒血清组

根据Ａ蛋白夹心酶联免疫吸附法（ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ）试验结果可以将我国分离的１６个黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）分离物及４个ＣＭＶ标准毒株（Ｆｎｙ、Ｌｎｙ、Ｍ、ＷＬ）区分为２个血清组．１４个分离物及标准毒株Ｆｎｙ、Ｍ属ＤＴＬ血清组，２个分离物及标准毒株Ｌｎｙ、ＷＬ属ＴｏＲＳ血清组     

应用A蛋白夹心酶联免疫吸附法鉴定黄瓜花叶病毒血清组

根据Ａ蛋白夹心酶联免疫吸附法（ＰＡＳ－ＥＬＩＳＡ）试验结果可以将我国分离的１６个黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）分离物及４个ＣＭＶ标准毒株（Ｆｎｙ、Ｌｎｙ、Ｍ、ＷＬ）区分为２个血清组。１４个分离物及标准毒株Ｆｎｙ、Ｍ属ＤＴＬ血清组，２个分离物及标准毒株Ｌｎｙ、ＷＬ属ＴｏＲＳ血清组。     

兔出血症病毒主要结构多肽的纯化及免疫保护性试验

人工感染ＲＨＤＶ－ＮＪ株病死兔肝经－５０℃反复冻融,氯仿处理,ＰＥＧ沉淀、差速离心,Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ柱层析得纯化病毒,纯化ＲＨＤＶ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣｕＣｌ２负染色后,切取主要结构多肽ＶＰ１（６４．５ＫＤ）凝胶带,除去ＣｕＣｌ２和ＳＤＳ获得ＶＰ１,高效液相色谱鉴定只有一个蛋白峰,Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔｔｉｎｇ,ＨＡ和ＨＩ结果显示纯化ＶＰ１具有良好的抗原表位稳定性。无母源抗体的３月龄兔１     

马铃薯Y病毒6kD和NIa基因转化的烟草介导抗病性

将马铃薯Ｙ病毒中国分离株（ＰＶＹ－Ｃ）的６ｋＤ和ＮＩａ基因拼接和改造，分别构建了其正向表述和反向转录的植物表达载体。借助土壤农杆菌ＬＢＡ４４０４将在此双元载体上的６ｋＤ和ＮＩａ基因及新霉素磷酸转移酶基因（ＮＰＴⅡ）转入到烟草品种ＮＣ８９的染色体上，从而获得了抗卡那霉素的转化再生烟草植株。用ＰＶＹ－Ｃ对这些转化烟草进行抗性接种试验，结果表明部分转基因植株能够抵制ＰＶＹ－Ｃ的侵染，对抗病植株的子一代（Ｒ１）进行进一步的抗性分析发现，其Ｒ１代通过遗传也获得了这种抗病性。     

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因转化辣椒的研究

以辣椒品种'B162'为试材,探讨了通过根癌农杆菌介导法将黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV-CP)基因转化辣椒的适宜条件.结果表明,将辣椒带柄子叶进行预培养2 d后,用D600 nm为0.3的根癌农杆菌菌液浸泡7 min,再经过共培养2 d后转移到筛选分化培养基中进行培养,有利于获得辣椒抗性不定芽.通过对获得的10株抗性不定芽进行PCR检测,其中有2株扩增出目的条带,初步证明CMV-CP基因已经转入辣椒不定芽中.     

应用低能离子束将抗菌肽ShivaA基因导入恢复系明恢63的研究(简报)

利用低能离子束介导转基因法于 1993年首次获得成功 ,本研究通过这一技术将抗菌肽ShivaA基因导入水稻恢复系明恢6 3成熟胚中 ,经过诱导愈伤和绿苗分化 ,并再生植株 ,经PCR检测分析证明外源基因已整合到再生植株基因组中。     

鸡γ干扰素在酵母中的分泌表达

根据GenBank已发表的鸡γ干扰素（ChIFN-γ）eDNA基因序列设计一对引物,以ConA刺激8h后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板．通过RT—PCR方法克隆出ChIFN-γ基因,将其连接到pMD18-T载体上获得阳性重组质粒。测序结果表明,该ChIFN-γ与GenBank上发表的ChIFN-γ序列的同源性可达99．6％,其含有1个495bp的开放性阅读框架,编码164个氨基酸。通过KpnⅠ和NotⅠ两个酶切位点将该基因插入酵母表达载体（pPICZa—A）,并将该重组酵母ChIFN-γ载体线性化,通过电转化使ChIFN-γ基因整合到酵母（X-33）基因组上,经甲醇诱导后,成功表达出ChIFN-γ。利用Western—blotting分析测定表达的ChIFN-γ蛋白的活性。结果表明,本试验得到的重组酵母ChIFN-γ是具有反应原性的蛋白。     

杂交向日葵高油恢复系选育方法

我们在多年的向日葵育种工作的基础上,通过广泛且深入的研究,针对实践中的问题,就如何选育高质量、高油份的向日葵恢复系提出可行性方法。市场上的国外高油“三系”向日葵杂交种是1种不容忽视的育种资源,我们可通过选育二环系的方法得到所需携有目的基因的恢复系;利用现有恢复系与国外向日葵杂交种的杂交途径把高油目的基因导入现有恢复系中,进而创造出新的高油恢复系;通过品系问杂交,对其后代进行系统选育来创造高油恢复系;把高油份、高品质的优良无恢复性的自交系,通过回交转育的方法将其改造成高油恢复系;轮回选择在向日葵育种中也是1种卓有成效的方法,我们通过全姊妹家系轮回选择的手段来最大限度地集合目的基因,最终得到优良恢复系。     

农杆菌介导水稻幼胚转化获转基因植株

本研究以根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ２３３）为供试菌株,以水稻幼胚为供试材料,对影响农杆菌介导基因的转化效率的因素进行了研究,确立了农杆菌介导的水稻高效转化体系。采用所确立的转化体系转化了Ｒａｄｏｎ、中国９１、０２４２８ ３个水稻品种（系）幼胚,结果表明,ｇｕｓ Ａ基因的瞬时表达率均在７０％左右,最高为７６％;ｇｕｓ Ａ基因稳定表达率均在２０％以上,平均为２３％。转基因植株的ＧＵＳ活性检测及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析表明,外源基因事于水稻基因组中,进行了有效地表达,且能稳定地遗传给后代,外源基因在后代遗传符合孟德尔遗传规律。     

水稻RACK1基因过表达载体的构建与转化

利用过表达基因技术将从水稻中分离克隆的RACK1基因定向克隆至植物中间表达载体pCAMBIA1301中,构建了RACK1过表达融合基因植物表达载体pCAMBIA1301/R,通过根癌农杆菌EHA105将其导入水稻基因组。对获得的抗性植株的报告基因、基因组PCR及Southern Blotting进行检测分析。结果表明,该过表达基因已整合到水稻基因组中。     

雌激素调控的绿色荧光蛋白在酵母细胞中的表达

采用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,用酵母细胞构建环境雌激素(EEH)的评价体系,可敏感、快速、方便地筛选出EEH化合物。通过分子生物学技术,将GFP基因插入到pM P 206/ERE启动子CYC 1的下游,用GFP取代L ac Z基因,并转化于酵母细胞。DNA测序发现ERE-CYC 1-GFP框架正确。对转化子进行PCR鉴定,发现有雌激素受体基因(hER cDNA)和GFP基因特异条带,说明hER cDNA和GFP已重组于酵母细胞。荧光显微镜下发现大量的绿色荧光颗粒,表明GFP基因在酵母细胞中成功表达。酵母细胞经不同浓度雌二醇作用后,与GFP表达量有剂量效应关系。与其他酵母评价体系相比,以GFP为报告基因评价EEH不需要破坏细胞壁,也不需要底物,可在96孔板中完成,这为高通量筛选EEH化合物奠定了基础。     

虾青素合成关键酶基因bkt植物表达载体的构建 及对玉米的遗传转化

虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素,具有广泛的应用价值。β-胡萝卜素酮化酶(Bkt)是由玉米黄素合成虾青素生物合成途径中的关键酶。采用LaTaqDNA聚合酶用PCR的方法从pET-28a( )bkt中扩增得到bkt基因,用bkt基因替换pBI221中的GUS基因形成含有CaMV35S启动子和NOS终止子的bkt基因表达盒,然后插入植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点,最终获得带有选择标记和报告基因的植物表达载体pCAMBIA1301-bkt。通过农杆菌LBA4404介导将其转化进入玉米自交系齐319,转化后的愈伤经GUS组织化学染色分析表明bkt基因已经转入玉米胚性愈伤组织。     

奶牛胚胎切割移植试验报告

以裸胚切割和透明带内切割两种方法,切割31枚奶牛早期胚胎,一分为二。将41枚半胚(其中38枚成对)分别移植给26头受体牛,6头移植怀孕,成功率为23.1%,移植有透明带的半胚和无透明带的裸半胚怀孕成功率都为25%。2半胚在同一透明带内(透明带内切割)的怀孕成功率为40%,而将裸半胚重新装入空透明带内的移植5头(受体全为黑白花奶牛),均未怀孕。桑椹胚分割成半胚移植怀孕成功率为21.1%,而早期囊胚则为28.6%。