猪流行性腹泻病毒部分S1基因克隆

为研究江西省PEDV流行株可能的变异情况,作者采用RT-PCR成功扩增了PEDV的部分S1基因,并将其克隆至T载体,经测序同源性分析,与PEDV标准毒株同源性在95%以上,说明成功的克隆了PEDV病毒部分S1基因,为将来进一步研究打下基础。     

猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR方法的建立

本研究根据GenBank中发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的基因组序列,设计筛选出两对用于双重RT-PCR反应的特异性引物,通过对特异性、灵敏性和稳定性等试验,建立了检测猪流行性腹泻病毒和猪瘟病毒的双重RT-PCR核酸检测技术。利用建立的CSFV-PEDV双重RT-PCR核酸检测技术,对某规模化猪场病料进行检测,结果表明,扩增出大小约311 bp和501 bp大小的特异性条带,为猪瘟与猪流行性腹泻病毒混合感染。建立的CSFVPEDV双重RT-PCR核酸检测技术具有良好的特异性、灵敏性和稳定性,该方法的建立为CSFV和PEDV的快速诊断、疫情监测及流行病学研究奠定了基础。     

我国部分省份猪流行性腹泻的流行病学监测

[目的]为摸清我国猪群流行性腹泻的感染状况,[方法]从2011年底到2014年3月,对云南、广西等29个省份开展了猪群腹泻疫情流行病学调查,采集、收集了发生腹泻症状的发病猪群样品（新鲜粪便、肠道组织等）,进行了猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等多种病原检测。[结果]在7021个调查猪场中,出现腹泻的阳性猪场4060个（57.83%）。在收集的1383份腹泻样品中,利用RT-PCR方法检测到PEDV阳性样本686份（49.58%）,其中腹泻发病猪样品中PEDV的检出率为67.82%,675份组织样品共检测出PEDV阳性样本86份（12.75%）。[结论]这表明我国猪场PEDV的感染十分普遍。对S基因进行分子流行病学分析发现,我国PEDV流行毒株与已有PEDV毒株可以分为2个完全不同的进化分支G1和G2,G1以CV777和DR13等疫苗株和早期毒株为主,G2则以2011-2013年流行毒株为主,流行毒株之间的同源性为97.8%-100%,与疫苗株CV777之间的同源性为94.3%-94.5%。     

猪流行性腹泻病毒的分离及RT-PCR方法的建立

应用RT-PCR方法对2012年华南地区某大型猪场疑似猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）病料检测,选取阳性病料接种vero细胞,培养至15代,出现明显的细胞病变。为了更好的检测该病毒,根据M基因设计引物,建立了一个快速的RT-PCR方法。     

猪流行性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立

为检测猪血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体水平,以纯化的PEDV作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV血清IgG抗体的诊断方法:当血清OD_(450nm)值0.31时,判定阳性;当OD_(450nm)值小于0.26时,判定阴性;当OD_(450nm)值介于两者之间判定可疑。结果表明,试验建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中猪流行腹泻病毒抗体、监测猪流行腹泻病的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的RT-PCR检测方法,根据GenBank中登录的PEDV M基因序列,设计并合成1对特异性检测引物,PCR产物为457 bp。结果显示:特异性试验,猪瘟病毒(CSFV)、大肠杆菌、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均为阴性,具有好特异性;敏感性试验,最低可检测到2.3×10-3μg/μL的PEDV DNA;126份临床上疑似为PEDV感染的病料,RT-PCR检测结果与商品试剂盒符合率为100%。表明本试验建立的PEDV RT-PCR检测方法可用于临床上PEDV感染引起的传染病病原学检测。     

猪流行性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与初步应用

为建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)病原的方法,根据GenBenk上的猪流行性腹泻病毒N基因序列,设计合成一对引物,建立了检测PEDV的一步法RT-PCR方法,并对其特异性、灵敏性及重复性进行了研究。结果表明:建立的一步法RT-PCR方法具有较好的特异性、灵敏性及重复性,最低可检测出约1pg PEDV的RNA。该方法为PEDV的病原检测及其分子流行病学调查提供了有效的诊断方法,可用于猪流行性腹泻的早期确诊和病毒鉴定。     

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立

猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)已经成为养猪行业的主要疫病。建立能够同时检测且能区分这2种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PEDV和PDCoV基因序列,分别用PDCoV M基因和PEDV M基因设计了2对引物,并对PEDV的M基因片段和PDCoV的M基因片段进行扩增,通过对PCR反应条件的优化,建立了检测PDCoV和PEDV双重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法。特异性和敏感度的试验表明,此方法对PDCoV和PEDV核酸的最低检测量分别为3.27×10~3拷贝/μL和3.63×10~4拷贝/μL,具有较高的敏感度;该方法可同时扩增出340 bp(PDCoV)和520 bp(PEDV),但不能扩增出猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪博卡病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。多重PCR与单一PCR符合率100%。表明此方法可以用于PDCoV和PEDV的检测。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立

试验根据GenBank上发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白基因序列,设计合成了一对寡聚核苷酸引物,扩增大小为245 bp的目的片段,建立起PEDV N基因的RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法具有很强特异性和很高的敏感性,可作为猪流行性腹泻临床快速诊断的一种方法。     

猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒双重RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777株和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Purdue P115株的基因序列,针对其基因保守区,设计1条共用的下游引物和2条各自病毒的上游引物,可特异扩增出大小分别为213 bp和546 bp目的条带。经过对TaqDNA聚合酶和Mg2+浓度、退火温度(Tm)等PCR反应条件的优化,最终确定该双重RT-PCR的最佳条件为TaqDNA聚合酶浓度为0.03 U/μL,Mg2+浓度为0.05 mmol/L,dNTP浓度为200μmol/L,Tm为51℃。特异性和敏感性检测结果显示,所建立的检测方法具有很好的特异性以及较高的敏感性。     

猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立

为了研究出一种快速、敏感、特异的诊断猪传染性胃肠炎和猪流行腹泻的方法,试验参照国内外已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因序列及其相关的RT-PCR检测方法,根据猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因和猪流行性腹泻病毒s蛋白基因各设计1套特异性通用引物,扩增目的带分别为426 bp和584 bp.结果表明:建立的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,可为猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础.     

宁夏某猪场猪流行性腹泻紧急流行病学调查

2017年5月10日,宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心接到青铜峡市某规模化猪场发生大规模腹泻的报告。经流行病学调查和实验室检测,确定猪流行性腹泻病毒是导致该猪群发生大规模腹泻的主要原因,生物安全管理水平不高、运输车辆或人员进场管理不严是疫病传入的主要风险因素;场内管理不严是疫情扩散的原因。按照调查建立的病因假设,采取了针对性防控措施,包括对猪场的入场清洗消毒设施等进行升级改造,加强饲养管理等。半年内该场未再发生大规模猪腹泻疫情。     

猪流行性腹泻的流行现状及防控策略

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种猪急性肠道传染病,两周龄以内的仔猪受其危害最为严重。本文介绍了猪流行性腹泻的流行现状、致病机理、疫苗研究进展以及防控策略,以期为本病防控提供参考。     

猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank报道的N基因高度保守核苷酸序列,设计并合成一对引物。上下游引物与Gen Bank中登录的153株猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因全长序列匹配度分别是100%和97%。以本实验室分离流行毒株为模板,利用SYBR Green I荧光染料法进行RT-PCR扩增,获得扩增产物构建重组质粒作为阳性对照,建立检测猪流行性腹泻病毒核酸的方法。同一样品进行3次重复试验,变异系数0.9%。通过对临床样品进行检测和测序验证,核酸检测结果中的阳性样品准确率为100%。本研究所建立的荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、准确等优点,可用于临床PEDV的检测及分子流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒与猪伪狂犬病病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒（PEDV）与猪伪狂犬病病毒（PRV）的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank已登录的PEDV膜蛋白M基因和PRV gE基因保守区域序列设计了2对特异性引物,以PRV和PEDV混合总RNA为反转录模板,初步建立了PRV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性验证和临床应用检测。结果显示,该方法对两种病毒的最低检测限均为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增PEDV和PRV细胞培养物,但对其他7种病原对照扩增不出任何条带,对26份临床疑似PEDV和PRV感染样品检测结果与测序鉴定结果完全一致。本研究成功建立了PEDV和PRV的二重RT-PCR检测方法,为临床上猪流行性腹泻和猪伪狂犬病的快速鉴别诊断提供了方法。     

检测猪流行性腹泻病毒的R-PCR方法的建立

根据猪流行性腹泻病毒 (PEDV)的N基因自行设计和合成了一对可扩增长度为 641bp目的片段的引物 ,成功地建立了检测的猪流行性腹泻病毒的RT PCR方法。对猪轮状病毒 (PRV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)的RT PCR检测结果均呈阴性。对PEDV JS株的RT PCR产物的序列分析表明 ,与CV777株的同源性为 97 3 %。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种适用于现场快速检测的猪流行性腹泻病毒(PEDV)LAMP技术,基于羟基萘酚蓝(HNB)的可视化显色特点,根据PEDV M基因编码区序列,设计合成1套引物,通过反应物浓度和反应条件优化,建立了可闭管检测的PEDV RT-LAMP检测方法。特异性和灵敏度试验结果显示,建立的RT-LAMP检测技术快速、灵敏、特异,可于1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID₅₀/mL的病毒RNA,与实时荧光RT-PCR检测方法灵敏度一致,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪链球菌2型核酸不发生交叉反应。利用该方法对187份送检的粪拭子及病死猪组织样品进行应用检测,检出阳性样品9份,与荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。试验结果表明,所建立的方法快速、特异,重复性满足要求,适用于送检样品的PEDV快速检测。     

猪腹泻相关病毒多重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。     

猪流行性腹泻病毒疫苗株与野毒株RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪流行性腹泻(PED)疫苗株与野毒株ORF3的特点设计特异性引物,建立能够快速区分PEDV疫苗株与野毒株的RT-PCR检测方法。建立的RT-PCR检测方法能够对PEDV疫苗株与野毒株扩增出特异性片段,其大小分别为278 bp和327 bp。该方法具有快速、特异、通用等特点,可用于实验室快速诊断、野毒株的区分,为该病的诊断及免疫防控提供参考依据。     

猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据Gen Bank登录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）毒株（登录号KJ960180）的M基因保守序列,设计1对扩增片段大小为299 bp的特异性引物,经PCR扩增、克隆、测序鉴定后,提取质粒作为阳性标准品,建立了PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法在1.21×10^3~1.21×10^8拷贝/μL范围内呈现良好的线性,相关系数（R2）为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线为单个特异峰,产物Tm值为85.5~86℃,最低检测限为1.21×10^1拷贝/μL。本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、成本低且操作简单,适用于PEDV的早期诊断、定量研究和流行病学监测。