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致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立 总被引:19,自引:2,他引:19
根据我国致病性嗜水气单胞菌分离株AH-78-2气溶素(Aer)基因保守区的测序结果,设计2对引物,建立了检测嗜水气单胸菌的PCR方法,通过对20株嗜水气单胞菌,12株相关菌株及157份送检病料的检测,并与SPA-CoA检测结果对照表明,PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可检测最低100cfu的细菌,该方法的建立为致病性嗜水气单胸菌的检测提供了一种简便,快速的新途径,以我国分离株的序列设计引物使该法具有更强的针对性。 相似文献
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致病性嗜水气单胞菌气溶素基因的克隆与高效表达 总被引:4,自引:0,他引:4
根据 Gen Bank中致病性嗜水气单胞菌气溶素 (Aer)基因的序列设计引物 ,以国内嗜水气单胞菌分离株为模板 ,扩增出 Aer基因的全长序列。经 T载体克隆和序列测定 ,证实克隆了国内分离株的不含信号肽的 Aer全长基因。将该基因以正确的读码框架与表达载体 p ET2 8b连接 ,经 IPTG诱导、SDS- PAGE检测 ,外源基因获得高效表达。诱导 4 h的培养物中 ,融合蛋白的表达占菌体总蛋白含量的 4 8.5 7%。 Western-印迹结果显示 ,利用纯化包涵体制备的兔抗血清可以很好地识别嗜水气单胞菌产生的天然毒素 ,而且天然毒素制备的抗体也能识别纯化的重组毒素 相似文献
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用PCR检测嗜水气单胞菌毒素基因 总被引:10,自引:0,他引:10
选取气单胞菌毒素基因中保守区的同源寡核苷酸序列为引物,用PCR技术检测临床分离的嗜水气单胞菌的毒素基因。扩增产物中均含有明显的预定条带;用AluI和AvaI酶切进一步鉴定,其酶切片段的数量和大小均与设计相吻合,证实样本中带有毒素基因。细菌在鲜血平板上呈现党大的β-溶血圈,用相应的单克隆抗体检测培养上清中的毒素,亦获阳性结果,进一步证实PCR技术检测气单胞菌毒素准确可靠。 相似文献
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嗜水气单胞菌研究进展 总被引:8,自引:0,他引:8
嗜水气单胞菌属于弧菌科气单胞菌属,在自然界分布广泛,可以感染多种水生及陆生动物并引起不同的疾病,是一种重要的人—兽—鱼共患病病原菌,本文概述了嗜水气单胞菌的分类地位和生物学性状,并对其鉴定方法、致病因子和由其引起的疾病进行了综述。 相似文献
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罗非鱼嗜水气单胞菌的分离鉴定 总被引:5,自引:1,他引:5
北京某鱼场饲养的罗非鱼陆续发病死亡,其体表鳞片局部出血,肝、胰、脾脏肿大坏死,肠腔积水等,从病死及濒死罗非鱼的肝、胰脏中分离到 4 株细菌,经形态学、生理生化特性及血清凝集试验,鉴定为嗜水气单胞菌。4 株细菌均能致死小鼠和鲢鱼。药敏试验表明,4 株细菌对环丙沙星、蒽诺沙星高度敏感,而对青霉素和红霉素不敏感。 相似文献
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刺激隐核虫LAMP检测方法的建立 总被引:3,自引:0,他引:3
为提高大黄鱼刺激隐核虫病的病原体检出率,本研究针对刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans) 18S-ITS2基因序列设计4条LAMP引物,在内外引物浓度比2∶1~6∶1、Mg2+浓度2 mmol/L、反应温度61℃~66℃、反应时间60 min的优化条件下,扩增产物经电泳后呈现特异性的LAMP梯形条带.本研究建立的LAMP方法具有高灵敏度(10-7 ng/μL DNA浓度),比常规PCR方法高100倍.将该方法应用于采集自不同地域的虫体样本、病鱼和水样以及不同组织样品的检测,结果在13份样品中有10份检出阳性,并显示该方法既能够检测发病鱼,也能够检出已感染但未发病的鱼.实验表明,该方法是一种能够快速、简易、特异、敏感地检测海水鱼类刺激隐核虫病的病原学检测方法. 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(2):256-264
以嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因为检测靶标,设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记探针,建立了嗜水气单胞菌的LAMP-LFD快速检测方法。该方法的流程可简单概括为将生物素标记的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)产物与FITC标记的探针进行特异性杂交,并使用横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)完成检测。经优化,LAMP最佳反应条件为63℃,反应30min,从LAMP扩增到LFD结果判读仅需40min,比常规PCR检测缩短近2h。试验结果表明,LAMP-LFD可特异性检出嗜水气单胞菌,对鳗弧菌等常见水产或食源性病原菌检测结果为阴性;其针对细菌纯培养物的检测灵敏度达2.03×101 CFU/mL或0.81CFU/反应,是常规PCR(以F3/B3为引物)的100倍;可从人工污染1×102 CFU/mL浓度的嗜水气单胞菌的鲫鱼肝组织匀浆样品中检测到细菌。嗜水气单胞菌(106 CFU)人工感染鲫鱼24h,传统的细菌分离培养方法可获得肝、肾的载菌量分别为1.2×105 CFU/g和6×103 CFU/g;利用LAMP-LFD技术可成功从鲫鱼的肝、肾组织中检测出该病原;以F3/B3为引物的PCR方法仅能从感染鲫鱼的肝组织中检测到该病原菌,表明面对实际感染样品,LAMP-LFD的检测灵敏度优于PCR方法。因此,该方法可快速、灵敏、特异地检测出嗜水气单胞菌,而且操作简单,仪器设备依赖性低,有望成为嗜水气单胞菌现场检测的常规技术手段。 相似文献
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嗜水气单胞菌粘附特性的研究 总被引:6,自引:1,他引:6
不同来源的6株嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)对10种不同红细胞的血凝试验表明,J-1株能凝集所有的10种红细胞,而与其他菌株的血凝谱有所不同。血凝图式有2种:人、鸡、麻雀的红细胞凝集快,呈大小不等的絮状;而鲫鱼、绵羊、猪、小鼠、兔、鸭、犬的红细胞凝集慢,且呈均匀颗粒状。这两种血凝均能被D-甘露糖抑制,但不能被J-1株R菌毛抑制。组织粘附试验显示,J-1株能粘附小鼠和鲫鱼的肠组织和肠绒毛。将提纯的R菌毛预处理肠组织,或用D-甘露糖或木瓜蛋白酶消化的R菌毛抗血清Fab片段预处理菌体,都不能抑制上述的粘附作用。J-1株对HEp-2细胞显示强粘附,菌体随机粘附在细胞上,有少数侵入细胞浆内。其余5株菌的粘附特性与J-1株不尽相同。所有6株菌对草鱼肠组织及肠绒毛、EPC细胞(鲤鱼乳头状上皮瘤细胞系)均无粘附性。 相似文献
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嗜水气单胞菌分离株ERIC-PCR及RAPD分型比较 总被引:1,自引:0,他引:1
采用ERIC-PCR和RAPD 2种方法对嗜水气单胞菌2009年分离菌株及实验室保存菌株共83株进行分子分型。参考相关文献设计并合成引物,分别进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳,电泳结果经Quantity One软件数值化后利用SPSS软件进行聚类分析。结果显示,除少数分离株外,使用2种方法对大多数菌株分型,均能得到多态性较好的指纹图谱。RAPD的AP12H引物能扩增出1~12个200~4 500bp之间的条带,可将嗜水气单胞菌分离株分为4群、12类。ERIC-PCR能扩增出4~16个100~5 800bp之间的条带,将嗜水气单胞菌分离株分为4群、17类,同一年代、同一地域分离株分别有聚成一类的趋势。2种分型方法均体现很好的分型能力。但ERIC-PCR分型与RAPD分型相比,重复性和稳定性更好,分辨力更高,且具备RAPD不要求模板序列已知而直接进行扩增的优点,更适合嗜水气单胞菌的分型研究。 相似文献
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为了解嗜水气单胞菌的肉鸭健康带毒、致病与耐药情况,对贵州省三穗县某肉鸭屠宰场临床健康肉鸭随机取样,进行嗜水气单胞菌的分离鉴定、毒力基因检测及耐药性分析。结果显示,分离菌具有嗜水气单胞菌典型的培养特征,菌落形态、菌体形态和生化特性均与嗜水气单胞菌相符;16 S rRNA基因序列系统进化树显示,该分离菌与嗜水气单胞菌聚为一支,同源性均>99%;动物回归试验显示,该分离菌对小鼠有较强的致病性;毒力基因PCR检测显示,该分离菌携带aer、hly、epa、act、alt和ahp等6种毒力基因;药敏试验结果显示,该分离菌对复方新诺明、磺胺嘧啶、环丙沙星和诺氟沙星等15种药物耐药;耐药基因PCR检测显示,该分离菌携带qnrB、Sul1和IntI1等3种耐药基因,与药敏试验表型相符。研究结果为嗜水气单胞菌的生物学特性研究及防控提供参考依据。 相似文献