胚胎冷冻技术及其在转基因小鼠中的应用

随着生物工程技术的发展．出现了许多生物工程小鼠品系．促使胚胎冷冻技术得到了广泛应用。胚胎冷冻技术不仅为转基因动物提供可用胚胎．还使胚胎移植不受时间、地域限制。简化引种过程．防止疾病传播,为建立优良动物的胚胎库提供了条件。综述了几种常用的胚胎冷冻方法及其在转基因小鼠中的应用研究．指出了胚胎冷冻方法存在的主要问题．并展望了其发展前景。     

小鼠胚胎冷冻和重复冷冻的研究

研究了不同冷冻方法对小鼠胚胎的冷冻保护效果及能否进行重复冷冻、重复冷冻后胚胎的继续发育率情况.采用乙二醇(1.8 mol/L、2.7 mol/L、3.6 mol/L、4.5 mol/L)和EFS玻璃化液(EFS20、EFS30、EFS40)对小鼠的桑椹胚和囊胚进行程序化冷冻和细管法玻璃化冷冻并再进行重复冷冻.结果表明以1.8 mol/L EG和EFS30对小鼠的胚胎冷冻效果最好,一次冷冻解冻后的发育率桑椹胚分别为92.5%和91.5%,囊胚分别为82.8%和81.3%,两种冷冻方法差异不显著(P>0.05).经1.8 mol/L EG首次冷冻再经EFS30重复冷冻的效果最好,桑椹胚和囊胚的发育率分别为53.8%和33.9%.     

实验大鼠、小鼠胚胎的缓慢冷冻和玻璃化冷冻的比较

对3日龄小鼠胚胎和5日龄大鼠胚胎进行了玻璃化低温保存和缓慢冷冻保存的比较研究,从经过超数排卵的小鼠和大鼠中收集到了1897个8－16细胞的胚胎,经筛选后将I级和Ⅱ级胚计1738个（91．62%）分别进行两种低温保存试验,并对其中的881个冷冻胚胎分阶段进行复苏,复苏率分别为65．03％（小鼠69．59％,大鼠60．46％）和68．45％（小鼠72．61％,大鼠64．29％）,两者间无显著性差异（P＞0．05）。在复苏在胚胎中,选择其中的488个胚胎进行移植试验,结果,玻璃化冷冻保存胚胎的移植的受孕率为39．47％（89／222）,缓慢冷冻保存胚胎的移植的受孕率为42．56％（115／266）,两种低温保存方法经方差检验也无显著性差异（P＞0．05）。     

安哥拉山羊胚胎冷冻试验

对安哥拉山羊用总量350IUFSH按递减法处理,配种结束后第6天经子宫手术回收桑椹胚和囊胚供冷冻试验.选用1.4mol/L甘油、1.2mol/L和1.5mol/L乙二醇做防冻保护剂,快速冷冻,-36℃投入液氮保存.采用直接水浴或在空气中停留6～10s使胚胎温度回升,再水浴解冻.胚胎解冻后,用0.5mol/L蔗糖PBSS脱除保护剂,移入2%PBSS中,手术移植于发情后6d的适移受体.结果表明,1.5mol/L乙二醇具有良好的冷冻保护作用.在18～20℃空气中使胚胎温度稍回升,再水浴解冻,可降低胚胎解冻过程中热应激导致的透明带破损,移植于适移受体的妊娠率达45.5%.     

不同冷冻保护剂对小鼠原核期胚胎玻璃化冷冻的影响

研究不同冷冻保护剂对小鼠原核期胚胎玻璃化冷冻的影响。结果表明,15%乙二醇(EG)+15%1,2-丙二醇(PROH)+蔗糖与15%EG+15%二甲基亚砜(DMSO)+蔗糖相比,解冻后成活率分别为84.83%和95.83%,无显著差异(P0.05);卵裂率(60%、70%)显著低于对照组(92.5%)(P0.05),冷冻组间差异不显著(P0.05);PROH组囊胚率(33.84%)显著低于DMSO组与对照组(56.35%、76.90%)(P0.05);DMSO组囊胚细胞数与PROH、对照组差异显著(P0.05)。试验证明,在乙二醇中添加PROH的冷冻效果不及添加DMSO组,玻璃化冷冻影响原核期胚胎的后期发育。     

奶牛冷冻胚胎规模化移植效果研究

为了提高奶牛良种化程度,对奶牛冷冻胚胎的规模化移植效果进行了研究。结果表明:PG二次肌注法的发情率显著高于(P<0.05)PG一次肌注法,两种方法的发情同期率均超过85%,受体牛发情时间多集中在肌注PG后48～72h;胚胎解冻后的复苏率达到82.58%,且早期囊胚与囊胚的复苏率要高于桑椹胚(P>0.05);共移植受体牛218头,受胎97头,受胎率为44.5%,且春、秋季的移植效果差异不显著(P>0.05)。为奶牛冻胚的规模化移植研究提供了参考依据。     

不同植冰温度下冷冻液的结晶变化及其对小鼠胚胎冷冻的效果

采用程序化冷冻方法 ,对不同植冰温度下几种冷冻液的结晶变化进行了分析 ,并比较了其对小鼠胚胎的冷冻效果。结果表明 ,- 5 .0℃植冰时 ,3种冷冻液 PEF、PGF和 PEGF只有部分结晶 ;当植冰温度为 - 5 .5℃时 ,PEF和 PEGF完全结晶时间为 1 0 min,PGF在 1 5 m in尚未完全结晶 ;- 6 .0℃植冰时 ,3种冷冻液完全结晶时间分别为 8,1 0和 1 0 min;- 6 .5℃植冰后完全结晶时间分别为 5 ,8和 5 min。将小鼠胚胎载入上述 3种冷冻液 ,- 5 .5℃植冰冷冻解冻后 ,囊胚孵化发育率分别为 81 .7% ,6 8.5 %和 87.5 % ,- 6 .0℃植冰时发育率分别为 80 % ,76 .5 %和 90 .9% ,- 6 .5℃植冰后的发育率分别为 1 0 % ,1 3.3%和 38.4 %。据此得出 ,在 - 5 .5或 - 6 .0℃时植冰 ,以 PEGF作为冷冻保护液冷冻保存小鼠胚胎效果较好     

首例冷冻胚胎克隆水牛在广西诞生

2008年2月26日13时40分,世界首例冷冻胚胎克隆水牛诞生。广西水牛研究所科研人员利用克隆胚胎冷冻技术,使一头杂交母水牛顺利产下一头冷冻胚胎移植的体细胞克隆雌性水牛犊,取名“盼盼”。是广西水牛研究所继利用国外优质种牛和本地水牛成功克隆出世界首例亚种间水牛之后的又一重大研究成果。     

小鼠胚胎直接投入液氮冷冻保存试验

室温下,将292枚小鼠胚胎在含128.9g/L甘油PBSS(含20％犊牛血清的磷酸盐缓冲液)和含193.2g/L甘油+85.6g/L蔗糖PBSS内分别孵育片刻,装管后直接投入液氮冷冻保存。冻胚快速解冻后,用含342.3g/L蔗糖PBSS脱去甘油,用PBSS清洗后镜下观察评定,胚胎回收率为86.9％(254/292),胚胎形态正常率为77.1％(196/254)。其中部分桑椹胚经体外培养,囊胚发育率为71.4％(20/28)。将110枚冻胚移植给7只受体,3只妊娠,产仔12只(5,7),妊娠率为43％(3/7),产仔率为10.9％(12/110),其中囊胚移植1只受体妊娠产仔3只,产仔率为25％(3/12)。     

小鼠和猪胚胎冷冻保存技术的研究进展

从胚胎冷冻保存技术原理对小鼠和猪胚胎冷冻发展速度相差悬殊的原因进行了概述,比较了小鼠和猪胚胎冷冻技术发展的历程及影响两种动物胚胎冷冻的因素,并展望了未来猪胚胎冷冻保存技术。以期能对今后的研究提供参考。     

小鼠胚胎冷冻保存条件研究

为探索在实验室条件下最佳的小鼠胚胎冷冻保存条件.对不同发育阶段小鼠胚胎按照同一个冷冻程序进行冷冻;两个不同的冷冻程序对同一个发育阶段的小鼠胚胎进行冷冻.结果表明,-7℃平衡10 min,然后以0.3℃/min的速率迅速降至-35℃,-35℃平衡5min后投入液氮中,此冷冻程序比较适合小鼠胚胎冷冻;冷冻保存对16细胞以上的小鼠胚胎影响较小.     

高效制备转基因小鼠的优化试验

为了优化转基因小鼠的制备技术,试验着重对注射DNA的制备、高质量受精卵的获得、显微注射、胚胎移植及早期胚胎检测等各步骤中的主要影响因素进行了优化。移植后出生的小鼠经PCR及Southern Blot检测,阳性鼠检出率由1.85%(2/108)增加到23.36%(25/107)。由此说明,通过注射DNA的改良、技术优化以及GFP在转基因动物中的应用,转基因效率可以得到明显提高,为高效制作转基因动物提供基础。     

培养用液对小鼠胚胎移植效果的影响

为提高小鼠胚胎移植的成功率,探索了合适的胚胎培养用液,研究了原核移植和囊胚移植对产仔率的影响.结果表明,CZB培养液适合ICR小鼠原核胚胎培养,囊胚发育率达到90.67%,囊胚移植的产仔率为53.33%,高于原核移植的34%.受体和供体不必同期处理,前者可比后者晚1 d处理.     

秦川牛胚胎冷冻保存效果

为探明秦川牛胚胎冷冻保存技术的可行性,将48头秦川牛母牛进行多次超数排卵处理、人工授精,并于授精后第7天非手术法获得胚胎,把获得的A级胚用不同浓度甘油(1.0~5.0 mol/L)和乙二醇(1.0~5.0mol/L)进行处理,并采用常规冷冻法和快速冷冻法进行冷冻,解冻后进行体外培养和不同发育阶段胚胎(桑椹胚、囊胚和扩张囊胚)移植,统计其存活率、孵化率和妊娠率等。结果表明:秦川牛7日龄胚胎能耐受甘油的浓度为2.0~4.0mol/L,乙二醇为1.0~3.0mol/L;常规冷冻法解冻后胚胎的存活率和孵化率显著(P0.05)高于快速冷冻法,胚胎移植妊娠率和产犊率差异不显著(P0.05);常规冷冻桑椹胚的冻后存活率、孵化率极显著(P0.01)低于囊胚和扩张囊胚,移植妊娠率和产犊率显著(P0.05)低于囊胚和扩张囊胚。     

羊胚胎生物技术研究进展及应用

阐述了胚胎移植、胚胎冷冻、胚胎分割、胚胎性别控制及体外受精等胚胎生物技术在养羊业的研究进展及应用现状。     

Production of Transgenic Mice by Type-A Spermatogonia-Mediated Gene Transfer

Type-A spermatogonia first appear at between 3-7 d postnatally in mice and are the only immortalized diploid cells that reproduce in adulthood in these animals. In our current study, we explored the feasibility of producing stable transgenic mice using these cells. Enhanced pEGFP-N1 plasmids were suspended in ExGen500 transfection reagent and injected at different angles into the testes of 7-d-old male ICR mice. The resulting type-A spermatogonia-mediated gene transfer (TASMGT) mice were then mated with normal females at different stages of sexual maturity (6, 12, and 24 wk). The integration and expression of the introduced EGFP gene was evaluated in the F1 transgenic offspring by PCR and Southern blotting analysis. The foreign gene integration rates for a low-dose group (15 μL gene suspension injected into each testis) and a high-dose group (30 μL suspensions injected) at the three stages of female sexual maturity tested were 11.76% (2/17), 14.29% (3/21), and 11.11% (2/18), and 5% (1/20), 5.56% (1/18), and 0 (0/17), respectively. The average integration rates for these two dose groups were 12.5% (7/56) and 3.64% (2/55), respectively, which was a significant difference (P<0.05). Semi-quantitative RT-PCR analysis further showed that the introduced GFP gene was expressed in 3/9 integration mice. In addition, GFP expression was observed in the sperm cells from the TASMGT mice, and also in the embryos and F2 pups from the F1 generation transgenic mice. Hence, although the foreign gene integration rate for TASMGT is not high and the transgenic offspring show as yet unexplained defects, our results indicate that this method is a potentially feasible and reproducible new approach to creating transgenic mice.     

移植方法和培养液对显微注射生产转基因小鼠的影响

研究了移植方法和培养液对显微注射法生产转基因小鼠的影响。结果表明 ,小鼠受精卵显微注射外源基因后 ,进行单、双侧输卵管移植 ,受体的妊娠率分别为 34.4 %和 37.5 % (P>0 .0 5 ) ,差异不显著 ;但仔鼠成活率分别为 83.6 %和 97.2 % (P<0 .0 5 ) ,差异显著。用 M2和改良的 M2培养液作为显微注射及移植工作液 ,体外培养的囊胚率分别为 17%和 35 % (P<0 .0 1) ,差异极显著 ,体内发育的情况也与这一结果相似 ,妊娠率分别为 35 .9%和 6 2 .5 % (P<0 .0 5 )。表明改良的 M2培养液的成分结构更适合小鼠胚胎发育的要求。     

转基因作物的研究进展与应用

从目的基因性状的类型、转化方法两方面综述了转基因作物的研究现状,并简述了转基因作物的研究发展历程及在全球和中国的应用概况。     

过氧化氢对小鼠骨髓微核率和孕鼠胚胎着床及生长的影响

通过体内试验研究了过氧化氢对小鼠骨髓微核率和胚胎着床及孕鼠生长发育的影响。将妊娠的昆明种(KM)小鼠分成5个处理组,分别为环磷酰胺(40.00 mg/kg)、蒸馏水和过氧化氢(500.00,125.00,31.25 mg/kg)组。于妊娠后6~15 d,每天采用灌胃给药,环磷酰胺组于妊娠后11~13 d腹腔一次性注射。每3 d称重1次,于妊娠第18 d称重后剖腹检查。另取雌雄各半KM小鼠分成5个处理组,分别为环磷酰胺、蒸馏水和过氧化氢(500.00,100.00,10.00 mg/kg)组,均采用灌胃染毒,每天1次,连续4 d,第5 d处死小鼠,取股骨髓液常规制片,计算红细胞微核率。结果表明,吸收胎和死胎数蒸馏水组为5.56%,中剂量过氧化氢组增加到19.53%(P<0.01),低剂量组增加到13.14%(P<0.05)。蒸馏水组小鼠嗜多染红细胞微核率为0%~0.002%,过氧化氢组增加到0.017%~0.032%(P<0.01)。在本试验剂量范围内过氧化氢有明显的胚胎毒性和遗传毒性。