海南白蚁共附生放线菌的分离鉴定及其抗热带作物病原真菌活性研究

白蚁（Isoptera）的筑巢和觅食活动主要在土壤及腐烂的木材上进行,所以白蚁极易受到来自环境病原微生物的侵害。因此,白蚁需要依赖共附生微生物菌群形成防御体系,放线菌是其中一个重要的类群,且放线菌能产生具有抗菌活性的次级代谢产物。但是白蚁共附生放线菌能否对热带作物的病原真菌有抑制活性有待研究。为了挖掘在热带农业绿色健康发展中具有应用潜力的海南特色农用放线菌资源,以海南白蚁共生放线菌为研究对象,利用平板分离法从采集的健康白蚁体内分离纯化放线菌,利用平板对峙法筛选生防菌株;通过分子生物学确定其分类地位;平板对峙法研究拮抗菌株的抗菌稳定性、持效性和广谱性;滤纸片法研究抑菌物质的热稳定性。结果从海南白蚁体内分离得到1株拮抗活性较好的放线菌菌株W7,系统发育树分析结果表明该放线菌与链霉菌属（Streptomyces）亲缘关系接近。菌株W7的抗菌活性持久性强,平板接种30 d后仍对植物病原真菌具有抑菌活性,抗菌稳定性好;菌株W7抑菌谱广,对16株植物病原真菌有不同程度的抑菌活性,其中对芒果胶孢霉（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、香蕉炭疽霉（Colletotrichum musae）、辣椒棒孢霉（Corynespora cassiicola）、豇豆瓜果腐霉[Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzp]抑制作用较强,对芦笋拟茎点霉（Phomopsis asparagi）、荔枝疫霉（Peronophythora litchi）抑制作用较弱;菌株W7发酵粗提物有较好的热稳定性,但是抑菌率会随着水浴温度的增高而降低。本文首次对海南白蚁共附生放线菌进行了分离鉴定,并从中筛选得到1株具有抑制多种热带作物病原真菌活性的生防菌株,为高效生防菌剂的研发提供新资源。     

北部湾海绵（Siphonochalina flexa）共附生细菌多样性及抑甘蔗鞭黑粉菌活性研究

分离纯化广西怪石滩海域海绵可培养共附生细菌,分析其多样性并研究共附生细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制活性,为研发新型生物农药提供参考依据。采用8种培养基分离纯化海绵共附生细菌,运用16S rDNA测序方法进行菌种鉴定及多样性分析,采用牛津杯法测试细菌发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌的抑制效果。经形态学分析及16S rDNA比对,海绵中共获得34株共附生细菌,隶属于18科24属。活性检测结果表示,存在14株对甘蔗鞭黑粉菌有抑制效果的菌株。海绵中可培养共附生细菌物种多样性丰富,部分菌株的发酵产物对甘蔗鞭黑粉菌具有较强的抑制效果,有成为新型生物农药的潜力。     

红树共附生微生物分离与抗白色念珠菌活性评价

对湛江市廉江高桥、东简北港2个红树林区红树的根、叶、花、果不同部位27份样品进行共附生微生物的分离及抗白色念珠菌活性的评价。采用改良M1培养基、改良马丁培养基和改良高氏一号培养基进行细菌、真菌和放线菌的分离,用美蓝酶标仪法对所筛菌株进行抗白色念珠菌活性评价。利用SPSS13.0软件对数据进行单因素方差分析和多重比较。从27份样品中共分离出384株红树林共附生微生物,其中细菌170株,真菌160株,放线菌54株,细菌和真菌为优势菌群,两者占分离总菌株数的86.0%;从384株分离菌中检测出64株具有抗白色念珠菌活性,占分离菌的16.7%;统计分析显示,除2个地区的抗白色念珠菌活性数无显著差异外,2个地区的红树共附生微生物的组成、不同类型共附生微生物的数量、不同类型共附生微生物的抗白色念珠菌活性、红树不同部位的共附生微生物数量与活性菌株数量均存在一定的差异。     

3株生防真菌的杀线虫活性及种类鉴定

大豆胞囊线虫是影响大豆产量的重要线虫,为了获得更多防治该线虫的真菌资源,在室内测定了生防菌D1、D7和A1孢子悬浮液对卵的寄生作用和发酵液的杀线虫活性。结果表明:孢子悬浮液处理12 d后,3株生防菌对大豆胞囊线虫卵的寄生率分别为68.83%、81.33%和79.50%。发酵液处理14 d后, 3株生防菌1×发酵液对卵孵化的抑制率分别为70.00%、77.78%和68.89%。3株生防菌发酵液处理3 d后,对二龄幼虫的校正死亡率分别为90.01%、86.74%和80.03%。通过形态学和rDNA-ITS序列比对及系统发育树分析,将菌株D1、D7和A1分别鉴定为曲霉属(Aspergillus sp.)、烟曲霉(A.fumigatus)和寄生曲霉(A.parasiticus)。     

椰子林土壤放线菌的分离及其拮抗椰子泻血病菌的鉴定

从椰子林不同类型土样中分离到101株放线菌,采用PDA培养基和高氏一号培养基及甲壳素脱乙酰酶培养基进行筛选。结果表明,以椰子泻血病菌为指示菌,用对峙培养法选出抑菌带宽度达18 mm以上的菌株14株,菌株FSD-14拮抗效果最明显,其次是FSD-27。这两种菌株对椰子芽腐病菌、椰子果腐病菌等供试真菌均有良好抑菌效果,对各供试病原真菌的抑菌带宽度达18 mm以上,F1S1、F26S1、S40-2、F20M4能产生甲壳素脱乙酰酶。通过对FSD-14的培养特征、生理生化指标及16S rDNA序列分析,确定该菌株属于浅灰链霉菌（Streptomyces griseolus）中的一员。     

广西山口8种红树林内生真菌的分离鉴定及抗菌活性菌株的筛选

采集广西山口8种红树林植物的多个部位,采用2种培养基分离培养红树林内生真菌;采用挖块法和琼脂扩散法对4种细菌和3种真菌进行抗菌试验。结果显示,从8种红树植物的根、茎、枝和叶上分离出104株内生真菌,叶片中共分出43株菌,数量最多。从白骨壤上分离得到菌株20株,占总菌株数的19.23%,比例最高。根据形态观察,内生真菌隶属8个类群及不产孢类,其中不产孢类46株,数量最多,其次是青霉属。抗菌试验筛选出20株内生真菌对至少1种指示菌具有抗菌活性。表明红树林内生真菌菌种资源丰富,这些菌株具有良好的抗菌活性,值得深入研究。     

花生黄曲霉毒素污染生防细菌筛选及菌株B85-1的鉴定和抗菌活性

从采自广西、江西、湖北及河北花生产区的花生荚果内分离到511株内生细菌。平板拮抗实验结果显示,有10株拮抗细菌对黄曲霉菌具有显著的抑制作用,拮抗带宽超过10mm,抑制率从45.5%~90.2%。实验发现8株内生拮抗细菌对黄曲霉菌生长及毒素产生有较强的抑制作用,对黄曲霉菌的防治效果为22.5%~65.0%,对黄曲霉毒素污染的抑制率为40.0%~90.5%,其中,菌株B85-1、B11-3及B50-9对黄曲霉菌的防治效果分别达到65.0%、60.0%和44.2%,抑毒率最强菌株为B85-1、B50-9及B78-5,抑毒率分别为90.5%、75.2%和74.5%。田间试验结果显示,菌株B85-1促生率及抑毒率最高,分别达到4.5%及65.5%,生防潜力巨大。经形态、生理生化及分子生物学分析,初步鉴定菌株B85-1为解淀粉芽孢杆菌。菌株B85-1发酵液、上清液、滤液及粗蛋白提取液对黄曲霉菌菌丝生长与孢子萌发均有较强的抑制活性。     

五指毛桃抗炎活性成分的分离及鉴定

以对5-LOX的抑制活性为抗炎活性评价指标,在活性跟踪下从五指毛桃中分离到6个化合物,经波谱数据分析后被鉴定为:羽扇豆醇棕榈酸酯(1)、β-香树脂醇乙酸酯(2)、补骨脂素(3)、芹菜素(4)、壬二酸(5)和胡萝卜苷(6),其中,化合物5、1对5-LOX表现出强的抑制活性,半数抑制浓度(IC50)分别为13.74μg/m L和13.96μg/m L;化合物1为首次从五指毛桃中分离得到。本研究结果可为五指毛桃的抗炎作用研究及其临床应用提供理论参考。     

白千层精油的化学成分与抑菌活性研究

研究白千层精油的化学成分及其对植物病原真菌的抑菌活性,为环境友好型农药的研发及白千层的综合应用提供理论依据。采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术分析了白千层精油的化学成分,并用菌丝生长速率法测定了白千层精油对4种植物病原真菌的抑菌活性。从白千层精油中分离鉴定出74种化学成分,占总含量的97.28%,其主要化学成分是左旋-α-蒎烯（2.07%）、β-月桂烯（1.05%）、1,8-桉叶素（67.29%）、萜品烯（2.52%）、芳樟醇（2.36%）、α-松油醇（7.93%）和(+)-g-桉叶油醇（1.26%）等。进一步研究表明,白千层精油在5.0~10.0 μL/mL浓度范围对立枯丝核菌菌丝生长抑制率为100%;处理2 d时,白千层精油在2.5~10.0 μL/mL浓度下对小孢拟盘多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌的菌丝生长抑制率达71.59%以上,其抑菌作用均随着处理浓度的增加而增强,随着白千层精油处理时间的延长,对3种植物病原菌表现出较好的持效性。白千层精油对立枯丝核菌、小孢拟盘多毛孢菌、水稻稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌均具有较强的抑菌活性,在农用抗菌剂应用中有较好的应用潜力。     

茶树内生真菌的分离和鉴定研究进展

植物内生真菌是指那些在其生活史的某一时期或全部阶段内生活在植物体内的、但对寄生植物组织并不引起明显的病害症状的真菌。目前,有关植物内生真菌生物学、生理生态学、次生产物化学的研究日益增多,显示了内生真菌具有重要的研究意义与广泛的应用前景,但茶树内生真菌的分离与鉴定研究尚未见系统报道。要开发茶树内生真菌,首先是从茶树体内分离得到微生物菌株,其次是对这些微生物菌株进行鉴定,本文就茶树内生真菌的分离与鉴定研究方法作了总结,以期为进一步研究和开发利用茶树内生真菌奠定基础。     

放线菌Snea49的种类鉴定及对胞囊线虫的活性评价

采用稀释分离法从辽宁沈阳市土壤中分离到1株放线菌Snea49.对Snea49进行了形态学特征、培养特征、生理生化特征及16S rDNA分析,初步鉴定为环状链霉菌(Streptomyces anulatus).利用离体测试法,研究了Snea49菌株代谢物不同倍数稀释液对大豆胞囊线虫的抑制作用.结果表明:10倍稀释液浓度下,该菌株对胞囊孵化的相对抑制率达82.60%,与无菌水对照差异显著.处理24h后,在1倍稀释液浓度下, 该菌株对2龄幼虫的校正死亡率是89.66%,各稀释浓度均与无菌水对照差异显著,该菌株有较高的杀线活性.     

假蒟中胡椒碱的分离鉴定及杀虫活性研究

为进一步探讨假蒟的杀虫活性成分,采用生物活性示踪法从假蒟乙醇提取物中分离纯化出1种活性成分,其化学结构经MS、1H NMR、13C NMR分析鉴定为胡椒碱。以螺旋粉虱为供试对象,采用叶片浸渍法测试胡椒碱及假蒟乙醇提取物对螺旋粉虱成虫和若虫的毒杀活性及杀卵作用,结果表明：胡椒碱及乙醇提取物对螺旋粉虱成虫和若虫均具有很好的杀虫活性,对成虫LC50值分别为28.59、224.31 mg/L,对若虫的LC50值分别为65.91、336.68 mg/L,胡椒碱对成虫的毒力优于若虫,与对照药剂印楝素无显著性差异;其杀虫活性明显高于假蒟乙醇提取物;胡椒碱及乙醇提取物有一定的杀卵作用,但作用方式有所不同,胡椒碱对初孵幼虫有较高的致死率,而假蒟乙醇提取物则明显影响螺旋粉虱卵的孵化。     

两株银杏内生拮抗细菌菌株的鉴定及生防功能基因研究

从表面消毒的银杏叶片中获得两株具有广谱拮抗活性的内生细菌菌株Zy25和Hy7;应用绿色荧光蛋白GFP基因标记该拮抗菌株,培养的菌液摩擦接种银杏叶片,分离结果表明两个菌株可在银杏叶片内稳定定殖;通过形态观察、生理生化指标测定及16S rDNA和DNA gyrase B subunit(gyrB)基因序列同源性分析,鉴定两个菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);利用特异引物对菌株的生防功能基因进行扩增,结果表明:bmyB、fenD、ituC、srfAA、srfAB、bioA、yngG和yndJ基因簇的片段在两个菌株中均存在,表明生防菌株Zy25和Hy7可能具有合成脂肽类物质的能力.     

一株野生大豆内生真菌YD-25的筛选鉴定及其抗重金属活性研究

为了丰富野生大豆内生真菌资源,探究野生大豆内生真菌的生物学活性。从野生大豆植株内分离筛选出1株内生真菌YD-25,通过形态学和分子生物学相结合的方式鉴定菌株;采用控制单因素变量试验和正交试验确定菌株的最适生长条件;通过对比胞内、胞外产物和对照组培养大豆幼苗的株高测定菌株的促生效果;测定菌株抗重金属铜、铅、镉的能力和重金属胁迫下菌体的抗氧化酶活性变化。结果表明:YD-25菌落初期为白色,后期变为橘黄色,菌丝分支且产孢;经鉴定该菌株为黑附球菌(Epicoccum nigrum)。该菌株生长的最适pH为3.0,优化培养条件为可溶性淀粉4%、酵母浸粉0.5%、KH_2PO_4 0.15%、MgSO_4 0.05%,培养8 d。YD-25菌株的胞外产物对大豆幼苗有较好的促生长作用,第4天和第6天的促生率分别达到了15.4%和18.1%。同时具有良好的耐重金属镉、铅、铜的能力,除受Cd²⁺胁迫的YD-25菌株的SOD活性之外,受其它重金属胁迫的YD-25菌株各项酶活性均随着重金属浓度提高有不同程度的提高。     

橡胶树炭疽病生防内生菌的分离鉴定及抑菌作用研究

目前化学农药的缺点日益突显,研发环保的生防菌剂是当前绿色安全的一种方法,筛选具有抑制橡胶树炭疽病的生防菌株,为研发新型生防菌剂储备资源。本文采用组织培养法分离纯化橡胶树内生菌,平板对峙筛选拮抗菌株;通过菌株培养特征、生理生化、根据16S rRNA和gyrA基因序列构建系统发育树确定其分类地位;采用平板对峙法研究内生菌株的抗菌持久性、稳定性、广谱性;采用牛津杯法研究拮抗内生菌对杀菌剂的敏感性。从橡胶树健康的根组织中分离得到4株对橡胶树炭疽病具有抑制作用的细菌（Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4）,系统发育树分析结果显示这4株细菌与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）亲缘关系很近,且培养性状和生理生化特征也与解淀粉芽孢杆菌相似。这4株内生菌的抗菌持久性强,抗菌稳定性好;对尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）DFMP1E和MLZZP3、小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）MF375898均有较强的抑菌能力,对茄类镰刀菌（Fusarium solani）XJ160901的抑制作用较弱;对多菌灵、异菌脲、百菌清、苯醚甲环唑4种杀菌剂均不敏感,有望开发为生防菌剂。     

软枝黄蝉杀虫活性成分的分离及鉴定

为进一步探讨软枝黄蝉杀虫活性成分,以菜青虫为靶标昆虫,采用生物活性示踪法分离鉴定软枝黄蝉杀虫活性成分,采用小叶碟添加法测定活性成分对菜青虫幼虫的杀虫活性;3种活性成分鉴定分别为黄蝉花定、黄蝉花辛和黄蝉花素。活性测试结果表明,3种活性成分对菜青虫5龄幼虫均有很强的拒食作用,处理后48 h AFC50值分别为0.071,0.045和0.103 mg/mL,同时,3种化合物对菜青虫还有较强的毒杀作用,其中,以黄蝉花素毒杀作用最强,其LC50值仅为0.026 mg/mL,优于对照药剂川楝素(0.033 mg/mL);环烯醚萜类化合物可能是软枝黄蝉主要的杀虫活性成分。     

海洋青霉HN89菌株次生代谢产物抗菌活性的研究

海洋青霉HN89菌株次生代谢产物的抗菌活性与发酵条件对抗生素产量影响的研究结果表明:海洋青霉HN89菌株的次生代谢产物对细菌、酵母、霉菌均有抑制作用;摇瓶发酵产生抗生素(HN89A)的最佳培养基成分为:玉米淀粉20g/L,黄豆粉2g/L,K2HPO41g/L,NaCl0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,FeSO4·7H2O0.01g/L,蛋白胨1g/L,用海水配制的海带汁(W/V,2%)1L,最佳发酵条件为28℃下振荡培养(200r/min)96~108h。合适的温度刺激能促进HN89A的合成。      

大麻白绢病生防菌贝莱斯芽孢杆菌的筛选鉴定及发酵条件优化

大麻白绢病是由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)引起的一种严重土传病害,主要危害大麻茎基部和根部,给生产带来巨大损失。该研究旨在分离大麻内生细菌,并从中筛选挖掘大麻白绢病生防菌资源。试验采用稀释涂布和平板对峙法进行大麻内生生防菌挖掘与筛选,根据菌株形态学特征、生理生化特性以及16S rDNA基因序列分析进行菌株鉴定,通过盆栽防效实验验证其生防效果,采用单因素试验及响应面设计试验优化其产生抑菌活性物质的发酵条件。试验获得一株对大麻白绢病菌具有显著拮抗作用的内生细菌024A,该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),其盆栽相对防效可达87.1%,具有良好的生防开发潜力。响应面法获得菌株024A的最佳发酵条件为：酵母粉浓度14.12 g/L、葡萄糖浓度11.84 g/L、发酵温度31.56℃、发酵时间17.91 h,预测抑菌率最高可达89.27%。     

四川老鹰茶醇提物的抑菌及抗氧化活性研究

以四川3个不同地区的老鹰茶及老鹰茶植物的鲜叶为原料,采用超声波辅助提取技术提取醇提物,测定多酚和黄酮含量以及抑菌和抗氧化性活性.结果表明:6种样品醇提物的提取率最高的为石棉老鹰茶鲜叶,为(26.73±0.68)％;总多酚和总黄酮含量最高的是石棉老鹰茶鲜叶,分别为(22.10±0.11)％和(16.77±0.14)％.6种样品醇提物对4种细菌均有抑制作用,且提取物浓度越高抑菌效果越强;其中石棉老鹰茶鲜叶对痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)抑制效果最好,抑菌圈直径达到(2.56±0.09)cm.6种样品醇提物的DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除能力和总还原能力均高于对照品BHT(2,6-二叔丁基对甲酚).6种样品抑菌和抗氧化能力结果由强到弱为石棉老鹰茶鲜叶>叙州老鹰茶鲜叶>青川老鹰茶鲜叶>石棉老鹰茶>叙州老鹰茶>青川老鹰茶.试验表明四川3个不同地区的老鹰茶及老鹰茶植物的鲜叶均具有较强的抑菌和抗氧化活性,其中石棉老鹰茶植物的鲜叶相对更好,可优先开发利用.     

儿茶素氧化产物的分离鉴定及其抗氧化活性研究

采用H2O2模拟氧化体系制备儿茶素氧化产物,经多级柱色谱分离得到一相对纯组分（t_R为9．825min）,HPLC-MS分析结果表明,所得级分主要含m／z 471及m／z 939两种产物,