鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定临床疑似鸭多杀性巴氏杆菌感染肉鸭的病原菌，本试验通过细菌分离培养、菌体形态观察、细菌生化鉴定、16S rRNA基因测序分析、细菌种特异性鉴定、荚膜分型鉴定和动物回归试验进行鉴定，并通过药敏试验和耐药基因检测进行耐药性分析。结果显示，从患病鸭肝脏组织分离到的细菌在鲜血琼脂培养基中呈现表面光滑凸起、灰白色菌落，为革兰氏阴性短小杆菌，瑞氏染色呈两极浓染；生化鉴定结果显示，分离菌能发酵葡萄糖、蔗糖和甘露醇，硫化氢、氧化酶和吲哚等试验阳性；16S rRNA基因序列系统进化树分析显示，该分离菌与多杀性巴氏杆菌聚为一支，同源性 > 99%；细菌种特异性鉴定结果与多杀性巴氏杆菌相符；荚膜分型鉴定结果仅扩增到约为1 050 bp的目的基因片段，与荚膜血清A型相符；动物回归试验显示，该分离菌有较强的致病性；药敏试验结果显示，该分离菌对羧苄西林、氨苄西林、复方新诺明和四环素等12种药物耐药；经耐药基因PCR检测显示，该分离菌携带Sul1、Sul3、tet（X）和Intl1 4种耐药基因，与药敏表型相符。本试验成功分离到1株鸭源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌，为鸭多杀性巴氏杆菌病的防治提供参考依据。     

云南猪源A型多杀性巴氏杆菌 PMJC-1株的分离鉴定

为探明2022年2月玉溪市江川区某规模猪场大批保育猪发病死亡原因，对采集病料进行了细菌分离，从肺门淋巴结分离得到一株菌落表面光滑、湿润、半透明圆形菌株。分离菌株经生化试剂条鉴定为多杀性巴氏杆菌，分离菌株的16S rRNA序列与NCBI GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌PM8-6株的同一性达到99%以上，将分离菌株命名为PMJC-1株。荚膜分型结果显示该菌株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌，毒力基因检测结果显示该菌含有黏附素、超氧化物歧化酶等6种毒力基因。分离菌株药敏试验表明，其仅对利福平、头孢哌酮、阿莫西林、呋喃妥因、头孢噻吩、大观霉素6种药物敏感，对其余18种药物均耐药。动物致病性试验结果显示该菌株对昆明小鼠具有较强致病性，8只实验组昆明小鼠在接种后72 h内发病死亡5只，其余3只发病后耐过康复。本研究结果可为生猪养殖过程中A型多杀性巴氏杆菌病的防治提供参考。     

奶牛荚膜血清A型巴氏杆菌的分离鉴定及致病性

山东省某规模化奶牛场10~30日龄的犊牛出现发热、咳嗽和关节肿大的临床症状,并造成部分犊牛死亡。为查明死亡原因并制定相应的防控方案,在流行病学调查和现场剖检的基础上,对采集的病料进行病理组织学检查、细菌分离鉴定、生化试验,并对鉴定的病原菌进行动物感染试验和药敏试验,对分离菌的PCR产物进行多杀性巴氏杆菌特异性基因和荚膜血清型特异性基因序列的测定。结果表明,该场犊牛主要死于以纤维素性肺炎为特征的败血症,死亡原因为多杀性巴氏杆菌感染所致,且分离的多杀性巴氏杆菌为荚膜血清A型高致病性菌株,对小鼠呈高致死性;该分离菌株对林可霉素、头孢噻呋、多西环素耐药,对恩诺沙星、氟苯尼考高度敏感。     

牛源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

从采集于黑龙江、天津的病牛肺组织中分离到2株病原菌,经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm-HLJ和Pm-TJ.参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmt1和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,合成引物,通过多重PCR扩增2株菌的种特异性基因和荚膜血清型特异性基因.选取Pm-HLJ的目标PCR产物进行克隆、序列测定、Blast搜索同源序列并且比较分析.结果显示,Pm-HLJ的kmt1基因片段全长460 bp,与GenBank中各血清型kmt1基因同源性均在96.6%以上;荚膜血清型A菌株特异性基因同源性为99.9%;而与其他荚膜血清型B、D、E、F的型特异性基因的同源性均低于50%.由此确认,分离的2株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型,这是我国A型多杀性巴氏杆菌引发牛出血性败血症的首例报道.     

牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株差异基因的SSH法筛选

近年来由于牛的频繁调运,由牛源A型多杀性巴氏杆菌引起的牛肺炎型疾病呈现出流行趋势。为探讨牛源A型多杀性巴氏杆菌强弱毒株间的基因差异,本研究利用抑制消减杂交技术(SSH)对牛源A型多杀性巴氏杆菌强毒株Pm CQ2和弱毒株Pm CQ6进行试验分析,共得到28个差异基因片段,测序比较发现其中27个与毒力、代谢、转录及DNA合成相关的基因片段,另1个基因片段所编码的为假定蛋白。该结果为牛源A型多杀性巴氏杆菌的后续致病机制研究提供了参考。     

一株猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

采用分离培养、生化鉴定、16S r RNA扩增片段同源性分析等方法,对采自四川某规模化猪场有明显呼吸道症状的猪肺脏拭子进行细菌的分离鉴定,并进行药敏试验及毒力试验。结果显示,分离得到1株多杀性巴氏杆菌,该分离株对头孢呋辛、头孢曲松、阿米卡星等19种抗生素敏感,对氨苄西林和麦迪霉素中度敏感,对苯唑西林表现耐药。小鼠毒性试验显示,该菌株对小鼠有强致病性。本研究为猪巴氏杆菌病的防控提供参考。     

一株禽多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为弄清湖南省某鸡场发病病因,对送检的病死鸡进行了解剖、组织细菌的分离,并对分离菌株进行了生化鉴定、16SrDNA扩增测序分析,且进一步测序分析了其荚膜和脂多糖PCR分型。解剖结果发现,6只鸡均有心包积液、肺脏实变、肝脏表面有许多针尖状灰白色的坏死点,脾脏和肠无明显症状。对采集组织脏器肝脏、肺脏、脾脏,接种TSA平皿后,均有长出卵圆形菌落。纯化后革兰氏染色为G-短小杆菌,经细菌鉴定仪鉴定为多杀性巴氏杆菌。16SrDNA测序结果显示其与巴氏杆菌美国株CCUG17978的同源性为100%;通过荚膜和脂多糖PCR分型鉴定为荚膜A型和脂多糖L1型。经使用巴氏杆菌较为敏感的磺胺类药物对应性治疗后,鸡群恢复健康。该鸡场发病系荚膜A型和脂多糖L1型巴氏杆菌感染。     

不同牛源多杀性巴氏杆菌HasR基因的克隆及序列分析

为了克隆从患肺炎犊牛和健康犊牛上分离的多杀性巴氏杆菌血红素结合受体(heme acquisition system receptor,HasR)基因并进行序列分析,分别以致犊牛肺炎和健康犊牛携带的多杀性巴氏杆菌DNA为模板,通过PCR反应扩增出血红素结合受体基因的全部序列,PCR产物纯化后克隆到pMD19-T载体上,经菌液PCR和酶切鉴定后进行序列测定。各菌株HasR基因序列比对结果发现,Pm-BS-a、Pm142-x-4、Pm142-x-3、Pm149-x、Pm-BS-d的序列之间亲源关系较近,而Pm149-xby与参考菌株Pm70的同源性较高。健康牛源的多杀性巴氏杆菌与致犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌之间HasR基因的同源性非常高,说明致犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌是一种条件性致病菌,其引起的犊牛肺炎可能属内源性感染。     

猪源多杀性巴氏杆菌荚膜分型及外膜蛋白H基因序列分析

为了解国内猪源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的变异情况及与荚膜型之间的相关性,本试验采用PCR方法对44株猪源多杀性巴氏杆菌进行荚膜分型和ompH基因的扩增测序。结果显示,44株菌株中22株为荚膜A型,17株为荚膜B型,5株为荚膜D型;44株菌株的ompH基因开放阅读框在1 002~1 056bp之间;SignaIP 4.1预测结果显示,信号肽为N端20个氨基酸残基;ProtParam分析结果显示,成熟蛋白氨基酸残基数量在313~331aa之间,推测的分子质量在33.83~36.46ku之间。序列分析结果显示,44株菌株核苷酸同源性为86.2%~100.0%,氨基酸同源性为86.0%~100.0%;ompH基因核苷酸序列遗传进化树结果显示,荚膜A型、B型和D型菌株分别在不同的分支。试验结果表明,猪源多杀性巴氏杆菌ompH基因在不同血清型之间具有较高的同源性,与荚膜型之间存在相关性。     

兔源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了对疑似感染巴氏杆菌的病死兔进行病原的分离、鉴定并分析其耐药情况，本试验对送检的病死兔进行剖检，结合传统分离培养及16S rRNA和荚膜抗原A(capA)基因的PCR扩增等鉴定病原菌，PCR方法扩增其23个毒力基因，最后进行药敏试验。结果显示，分离菌在血琼脂培养基的菌落特征为光滑、湿润、半透明、灰白色、圆形、露珠状，染色镜检可观察到革兰阴性、两端染色较深的红色短杆菌。PCR扩增及测序结果显示，该分离菌株的16S rRNA和capA基因与多杀性巴氏杆菌Q菌株(GenBank登录号：CP033597)同源性分别为99.86%和100%。23个毒力基因中仅pfhA、oma87、fur、pmHAS基因检测出目的条带，其余19个毒力基因均未检出。该分离菌株对环丙沙星、氧氟沙星、头孢拉定、氨苄西林、卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素、红霉素和多黏菌素B共9种药物敏感，对四环素、复方新诺明和克林霉素等耐药。结果表明本试验从病死兔中分离鉴定出1株荚膜血清A型的多杀性巴氏杆菌，可选用环丙沙星和红霉素等进行治疗。该结果可为临床巴氏杆菌病的治疗提供一定的理论依据。     

鹅源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定与药物敏感性分析

为了鉴定引起雏鹅死亡病原,无菌采集肝、心、肺等病料组织进行细菌分离培养,通过分离培养、培养特性鉴定、形态学观察、生化试验、16 S rRNA PCR等方法进行鉴定。结果显示:分离菌株16 S rRNA基因序列与GenBank中公布的12株多杀性巴氏杆菌参考株的同源性在98%~100%之间,分离菌株为多杀性巴氏杆菌;动物回归试验结果表明,该菌具有致病性,且致病较强,对雏鹅的LD_(50)为3.16×10~6cfu/mL;PCR检测结果表明,分离菌株属于多杀性巴氏杆菌荚膜型A型,同时携带18个毒力基因;药敏试验结果显示,分离菌对恩诺沙星、丁胺卡那霉素、头孢曲松等11种药物高敏,对其他药物存在不同程度的敏感性。     

肉牛多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏分析

为调查多杀性巴氏杆菌在河北省部分地区肉牛群中的流行情况,本课题组从规模化肉牛养殖场中采集患有呼吸道综合征的病牛鼻腔拭子进行细菌分离鉴定、荚膜血清分型、毒力基因检测、动物攻毒试验及药物敏感性分析。结果显示,从105份鼻腔拭子中共分离了25株多杀性巴氏杆菌;菌株荚膜分型均为A型,携带ptfA、exbB和nanH等多种毒力基因,LD_(50)显示多数菌株毒力较强;分离菌株对大多数药物敏感性较高,但对复方新诺明、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和林可霉素药物耐药性较高,耐药率达到80%以上。     

1株羊源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

为了确定和分析新疆某羊场患呼吸道疾病病例的细菌性病原，采集病死羊的肺脏、胸腔积液等样品进行细菌分离，通过生化试验、16S rRNA基因测序、特异性引物PCR鉴定、药物敏感性试验、毒力基因测定、对小鼠半数致死量(LD₅₀)测定等方法对分离株进行生物学特性研究。结果显示，从病羊胸腔积液中分离鉴定出一株荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌，将其命名为Pmh7。Pmh7对链霉素、头孢呋辛等10种抗菌药物敏感，对万古霉素、杆菌肽等5种抗菌药物耐药；携带6个毒力基因(fimA、nanB、ompH、sodC、Oma87、sodA),对小鼠的LD₅₀为2.3×10~6 CFU。结果表明，引发该羊场呼吸系统疾病的病原为荚膜D型多杀性巴氏杆菌，有较强的致病性。本研究结果可为防治羊巴氏杆菌病提供参考，为巴氏杆菌病的流行病学监测奠定基础。     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其荚膜血清型鉴定

从病死母猪肺脏中分离到一株革兰氏阴性小杆菌,用生理生化鉴定、药敏试验、致病性试验和PCR鉴定方法对分离菌株进行鉴定,并用多杀性巴氏杆菌荚膜分型引物对分离株的荚膜血清型进行鉴定。结果表明:本菌为猪多杀性巴氏杆菌,对多种抗生素高度敏感,对小白鼠有强致病性;PCR扩增16SrDNA基因获得1415bp片段,分离株的16SrDNA核苷酸序列与多杀性巴氏杆菌(AY078999)的同源性为99%,因此该分离菌株被鉴定为致病性巴氏杆菌,命名为YN20110122株;本菌分离株为荚膜A型血清型多杀性巴氏杆菌。     

牦牛肺炎病原多杀性巴氏杆菌和殊异支原体的分子鉴定与分析

青海省刚察县某牦牛产业基地牦牛发生咳嗽,鼻孔有分泌物流出,呼吸困难等症状的疾病。为快速确诊发病牛的致病原因,及时防控和治疗,从发病和病死的牦牛中,采集鼻腔拭子和肺脏、胸腔积液,利用PCR方法进行分子鉴定与分析。结果显示:此牛场中引发肺炎的病原是A型多杀性巴氏杆菌和殊异支原体两种病原体混合感染,测序结果显示5个有效样品中鉴定的为完全相同的病原,P.multocida-GC1的Kmt基因与参考序列中国株CP031554/3/2/1同源性在99%以上,M.dispar-GC1与参考序列的16S rRNA基因同源性在97%以上。同时在遗传进化角度再次分析确认了鉴定的P.multocida与中国和俄罗斯的A型多杀性巴氏杆菌聚成一大支;鉴定的M.dispar与殊异支原体聚为一支。结果表明,青海刚察地区牦牛存在感染多杀性巴氏杆菌和殊异支原体的潜在风险,该研究为牦牛呼吸道疾病与肺炎的病原学调查和病原的流行病学调查提供了参考数据。     

一株鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为了确定引起湖北省荆州市某养鸡场鸡群发生疑似禽霍乱死亡的原因,试验从该养鸡场采集病死鸡的肝脏病原,通过细菌分离鉴定、16S rDNA克隆测序分析、荚膜和脂多糖PCR分型、药敏试验及致病性试验对病原进行了研究。结果表明：分离菌株呈革兰氏染色阴性,瑞氏染色为两极浓染的球杆菌;分离菌经荚膜和脂多糖PCR分型鉴定为荚膜B型、脂多糖L2型,将其命名为JZ-B-1;JZ-B-1菌株与巴氏杆菌的同源性高达99%以上,在系统进化树中分别与多杀性巴氏杆菌属和多杀性巴氏杆菌败血亚种处于同一分支上,属多杀性巴氏杆菌败血亚种;菌株JZ-B-1对哌拉西林、羧苄西林和青霉素有耐药性,对头孢他啶、头孢呋辛、头孢拉定、头孢唑林、头孢哌酮、头孢曲松、氨苄西林、四环素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、氯霉素、呋喃唑酮、万古霉素、氧氟沙星、诺氧沙星、麦迪霉素高度敏感。说明从病死鸡中分离的菌株为荚膜B型多杀性巴氏杆菌属败血亚种,丰富了鸡源多杀性巴氏杆菌的生物学亚型,对湖北地区巴氏杆菌病的防控和细菌耐药性研究具有一定的指导意义。     

6株山羊源多杀性巴氏杆菌血清型、耐药性及致病性分析

为了研究6株分离自四川省内江市2个养殖场患病山羊支气管的多杀性巴氏杆菌的主要生物学特性,试验采用特异性PCR方法鉴定多杀性巴氏杆菌血清型,采用纸片扩散法(Kirby-Bauer)评价了临床分离菌株对14种抗菌药物的敏感性,采用Reed-Muench法测定分离菌株对昆明小鼠的半数致死量(LD_(50)),分析其致病性。结果表明:在6株多杀性巴氏杆菌中,4株为A型,2株为B型。分离菌株对青霉素和林可霉素100%耐药,而对复方新诺明和氟苯尼考具有较高的敏感性。分离菌株对昆明小鼠的半数致死量均大于5×10~(8.0) cfu/0.5 mL,致病性较弱。说明本次分离的山羊源多杀性巴氏杆菌菌株为弱毒株,丰富了我国山羊源多杀性巴氏杆菌的生物学特征,为其感染的防控提供了有用的信息。     

猪肺疫多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为了研究四川乐山某猪场爆发的保育猪严重呼吸道疾病的主要病原,试验采用病理剖检、病毒检测、细菌分离鉴定、生化鉴定、动物回归试验以及多杀性巴氏杆菌种特异性KMT基因的PCR检测对病原进行鉴定。结果表明:发病猪有严重肺炎症状,支气管内部有少量泡沫,腹股沟淋巴结出血、水肿,其他实质器官未见明显病理变化;病毒检测结果显示为蓝耳病病毒阳性,猪瘟病毒、伪狂犬病毒、圆环病毒2型阴性;从病猪肺脏中分离获得大肠杆菌和1株蓝耳病病毒继发的高致病性多杀性巴氏杆菌;该分离菌株对多种药物均高度敏感。     

犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

新疆石河子6个规模化奶牛场相继出现出生1～9周龄的犊牛发生体温升高、呼吸困难以肺部感染为主,部分犊牛发生腹泻的疾病,造成90余头犊牛因肺炎死亡.从其中2个发病牛场死亡犊牛采集痛料,经涂片镜检、细菌分离培养、生化鉴定及动物试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌,分别命名为Pm142-x-3、Pm142-x-4、Pm149-xby、Pm149-x,参考多杀性巴氏杆菌种特异性基因kmtl和荚膜血清型特异性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD序列,合成引物,进行PCR扩增.选取Pm149-x-3的目标PCR产物进行序列测定并分析比较,结果表明,Pm149-x-3的kmtl基因片段全长为460 bp,与GenBank中各血清型kmtl基因核苷酸同源性为99.4%;荚膜血清型A菌株特异性基因核苷酸同源性为97%;而扩增其他荚膜血清型B、D、E、F的型特异性基因均未获得目的条带.由此确认,分离的4株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型.药敏试验表明分离的多杀性巴氏杆菌对氧氟沙星、庆大霉素敏感.     

犊牛支原体肺炎继发牛A型多杀性巴氏杆菌感染的诊治

某奶牛场犊牛相继发生肺炎和关节炎,为确诊该牛场犊牛群发病的原因并提出防控方案,本试验剖检新生犊牛并采集病料,分别开展牛支原体及其他病原菌的分离培养、PCR鉴定及药敏分析;进行牛病毒性腹泻病毒、牛口蹄疫病毒和牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测;制作犊牛肺脏组织病理切片并进行观察和评估。从犊牛肺脏组织分离到牛支原体和牛A型多杀性巴氏杆菌;牛病毒性腹泻病毒、牛口蹄疫病毒和牛传染性鼻气管炎病毒检测均为阴性;肺脏组织病理切片可见肺泡结构破坏、出血及大量炎性细胞浸润;药敏试验结果显示,牛支原体和牛A型多杀性巴氏杆菌分别对泰乐菌素和头孢唑啉敏感,但对青霉素、庆大霉素、林可霉素和氨苄西林均呈现耐药。该犊牛群确诊为牛支原体肺炎继发牛A型多杀性巴氏杆菌感染,采用泰乐菌素联合头孢唑啉肌肉注射,配合对症治疗和规范管理,有效控制了该场犊牛疾病。