牛传染性鼻气管炎gE基因TaqMan-MGB与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法，本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物，分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，并对2种方法进行了综合比较。结果显示，TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×10¹ copies/μL和1.0×10² copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性；重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品，2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明，2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。     

针对猪瘟病毒E2蛋白的实时荧光定量PCR方法的建立及应用

根据猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的保守序列,设计合成一套特异性引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化后,检测其特异性和灵敏性。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR在101～108范围内线性相关系数为0.997,能够检测到相当于10 copies/μL的病毒核酸,比常规PCR检测方法敏感性强;采用建立的实时荧光定量PCR方法检验猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型呈现阴性结果,特异性强;变异系数为0.09%～0.7%,小于1%,具有良好的重复性。本研究建立的猪瘟病毒实时荧光定量PCR方法为临床上猪瘟病毒的诊断和定量研究提供了重要的检测工具。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究根据PRRSV GL膜蛋白基因和CSFV多聚蛋白基因,分别设计2对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果表明,该方法只对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒特异性良好,不与非洲猪瘟、猪圆环病毒Ⅱ型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒等常发猪病存在交叉反应;PRRSV和CSFV的检出下限分别为1.41拷贝/μL和1.6拷贝/μL;组内和组间Ct值变异系数都小于1.3%。对175份临床采集的样品检测,PRRSV单一阳性样品27份,CSFV单一阳性样品16份,检测双阳性样品24份。本方法敏感高、特异强,可以用于猪场的快速检测与诊断。     

同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT-PCR方法的建立

应用猪瘟病毒（CSFV）及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）特异性引物和TaqMan水解探针,建立一种同时检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT—PCR方法。该方法可检测到3．2TCID50的CSFV和1．8TCID50的北美洲型PRRSV,比常规PCR方法敏感性高50倍以上。用复合荧光定量RT—PCR方法对155份现地样品进行检测,结果73份为PRRSV阳性,16份为CSFV阳性,13份为CSFV和PRRSV混合感染,与常规RT—PCR的符合率高达99．4％。该复合荧光定量RT—PCR方法敏感、特异、重复性好。     

猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光定量PCR方法的建立与应用

为了建立能够猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)和非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)双重荧光定量PCR方法,试验比对了CSFV与ASFV的基因组序列,针对CSFV 5′-UTR和ASFV B646L保守靶序列,分别设计2条特异性引物及1条TaqMan探针,通过优化扩增体系和程序,建立可同时检测CSFV和ASFV的双重荧光定量PCR方法,并建立该方法的标准曲线,同时用敏感性试验、特异性试验和重复性试验对该方法进行评价,最后检验该方法的应用效果。结果表明：CSFV和ASFV标准曲线的相关系数(R²)分别为0.999和1,线性关系良好;CSFV与ASFV的最低检测浓度分别为1.3×10⁰ copies/μL和2.4×10⁰ copies/μL;与其他常见猪只病原检测无交叉反应;批间与批内变异系数均小于2%,稳定性良好。试验建立的方法对44份临床样本的检测结果与《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法》(GB/T 27540—2011)和《非洲猪...     

PCV4 SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型（PCV4）的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×102~5.64×109 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×102 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。     

非典型猪瘟病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照GenBank上登录的非典型猪瘟病毒(atypical porcine pestivirus virus,APPV)全基因组序列设计特异性引物成功从感染APPV阳性样品中扩增出270 bp的APPV基因片段,并将其克隆到pEASY-Bluent Zero Cloning Kit载体,以纯化的重组质粒为模板优化反应条件,建立了检测APPV的特异性荧光定量PCR方法。结果显示,建立的荧光定量PCR方法C_t值与标准品在1.49×10~1～1.49×10¹⁰ copies/μL呈现良好的线性关系,相关系数为R^20.999,斜率为-3.442,扩增效率为95.207%。该方法与PCV2、PRV、PRRSV、PPV及CSFV基因组均无交叉反应,敏感性比常规PCR高出1 000倍,组内和组间重复试验变异系数均小于2%。对临床采集的20份疑似感染APPV的样品进行检测,结果显示应用所建立的荧光定量PCR成功检测到3份APPV阳性样品,而常规PCR仅检测到1份,表明所建立的荧光定量PCR比常规PCR灵敏度更高。本试验所建立的APPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,可实现对APPV早期诊断及感染进行定量分析检测。     

A型猪塞内卡病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

本研究针对A型猪塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA)基因组保守区域设计了特异性引物及探针,建立了快速检测SVA的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的Taq Man荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9974;特异性良好,与口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒不存在交叉反应;对SVA核酸最低检测下限为3.75 copies/μL,而普通PCR最低检测下限为3.75×103 copies/μL;批内和批间的变异系数为均小于5%,重复性良好。本研究建立的SVA TaqMan荧光定量PCR方法为检测猪水疱性疾病病原提供了一种快速、灵敏的检测方法,为开展SVA流行病学调查提供了技术支持。     

火鸡疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

本研究针对火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)FC-126毒株sorf1基因序列,设计特异性的扩增引物和探针,建立了检测HVT的TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行检测。结果表明,建立的荧光定量PCR方法灵敏度高,最低可检测到1×10~2 copies/μL,比普通PCR灵敏10倍;对鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、鹅细小病毒、4型禽腺病毒和8型禽腺病毒均无特异性扩增,具有较好的特异性;组间和组内变异系数均小于1%,表明该方法重复性好。用建立的荧光定量PCR方法对82份HVT样品进行检测,结果43份为阳性,普通PCR只检测出30份阳性样品。结果表明本研究建立的HVT TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重要性好,为监测HVT的病毒含量提供了一种有效的手段。     

实时荧光定量PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒

根据GenBank发表的猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守区域的序列分别设计了2对特异性引物。建立了一种快速检测CSFV和PRRSV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法检测采集的临床疑似病料。结果表明,建立的CSFV、PRRSV-SYBR GreenⅠPCR有较好的特异性,敏感性和重复性,可以用于CSFV和PRRSV的检测。     

猪瘟病毒野毒株RT-LAMP可视化检测方法的建立

本研究旨在建立一种可视化检测猪瘟病毒(CSFV)野毒株的反转录.环介导等温扩增方法(RT-LAMP).根据CSFV的NS5B基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,利用Bsf DNA聚合酶,在62℃恒温条件下进行扩增,扩增产物中加入sYBR Green I染料直接或在紫外光下观察判定扩增结果.该方法可检测出不同基因型的CSFV厂野毒株,其检出极限为2.5 TCID_(50)的CSFV,与实时荧光定量RT.PCR方法的敏感性相当;特异性试验表明,该方法对猪瘟免化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒均无扩增反应;通过对126份不同样品进行检测比较,该方法与实时荧光定量RT-LAMP检测方法的符合率达100%.与引物.探针能量转移PCR方法的符合率为98.4%.该方法无需特殊仪器,是一种适用于基层的快速、简便的CSFV野毒鉴别检测方法.     

Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR for quantitative and differential detection of wild-type viruses and C-strain vaccine of Classical swine fever virus

Classical swine fever virus (CSFV) is the causative agent of classical swine fever (CSF), one of OIE listed diseases. Most of the currently available detection methods do not allow discrimination between wild-type CSF viruses and the vaccine strains. This study was designed to develop a multiplex real-time RT-PCR for the quantitative and differential detection of wild-type viruses and C-strain vaccine widely used in China. CSFV specific primers and two differently labeled TaqMan probes for the differentiation of wild-type viruses from C-strain vaccine were designed in the 5'-untranslated region of the viral genome of CSFV. The two TaqMan probes specifically hybridize wild-type viruses of different subgroups and C-strain vaccine, respectively, in the multiplex real-time RT-PCR, with no cross-reaction to a number of non-CSFV porcine viruses. The sensitivity of the assay for detecting wild-type and C-strain-type vaccine viruses was determined to be 41.8 and 81.5copies/microL viral RNA, respectively. Completely correct differentiation of wild-type viruses from C-strain vaccine was achieved when testing reference strains and characterized field isolates of CSFV in China. The multiplex real-time RT-PCR was able to detect the viral RNA in the whole blood samples of experimentally infected pigs as early as 2 days post-infection, 3 to 4 days prior to the onset of clinical signs in co-housed pigs. The agreements between the multiplex real-time RT-PCR and a multiplex RT-nested PCR for detection of wild-type and C-strain-type viruses were 96.9% and 100%, respectively, when detecting 106 different field samples. There is a positive correlation between the titers of C-strain vaccines titrated in rabbits and RNA copies quantitated by the multiplex real-time RT-PCR. The novel assay described here is rapid and sensitive, and is useful for differentiating field strains and C-strain of CSFV in China.     

鸭呼肠孤病毒TaqMan与SYBR Green荧光定量检测方法的建立及比较

本研究旨在针对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)建立两种快速、敏感、特异的荧光定量PCR诊断方法并对其临床实用性进行比较.试验根据呼肠孤病毒S1基因序列设计合成1对特异性引物和1条MGB探针,分别建立TaqMan和SYBR GreenI两种荧光定量PCR检测方法,并对两种方法的特异性、灵敏性、重复性进行比较.结果 显示,两种...     

猪IL-4、IL-6和IL-10 SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立及应用

为探讨PRRSV感染后机体的体液免疫应答、从分子水平深入研究PRRSV的免疫机制,本研究针对Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10以及看家基因β-actin的基因序列分别设计一对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-4、IL-6、IL-10及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。该方法线性关系好,各种细胞因子及β-actin标准曲线的相关系数均达到0.997以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达到1×101copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%。应用所建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染仔猪外周血单个核细胞(PBMC)中IL-4、IL-6和IL-10mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,本研究建立的real-timePCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于猪Th2型细胞因子的检测及定量分析。     

鸡减蛋综合征病毒Hexon基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。     

鸭瘟病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸭瘟病毒（DPV）快速、敏感的检测方法,本研究利用PCR技术扩增出DPV UL30基因中510bp的保守序列,并克隆到p MD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了DPV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达5×101拷贝,与鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭H9亚型流感病毒和鸭副粘病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床DPV的检测。     

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

为实现对伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRV gD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数（R²）分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。     

EHP、SHIV双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的构建及应用

本研究根据GenBank中已有的虾肝肠胞虫(EHP)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)基因的保守序列,设计特异的引物和探针.建立了快速诊断EHP和SHIV的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和稳定性进行检测.结果表明:该方法检测限可达10 copies/μL,其敏感性是SYBR Green r...     

采用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法对猪瘟强毒与疫苗弱毒的鉴别研究

为建立一种能够区分猪瘟病毒(CSFV)强毒与弱毒疫苗C株的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法,本研究对GenBank中登录的25株CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗C株全基因组序列进行比较分析,设计一对共用下游引物以及分别针对CSFV强毒株与弱毒疫苗的特异性上游引物,其Tm值分别为84.5±0.5℃和88.5±0.5℃,熔解曲线分析显示为单特异峰.检测结果显示本实验建立的鉴别CSFV强毒感染与弱毒疫苗的荧光定量RT-PCR结合熔解曲线分析方法特异性强,对其他相关病毒无特异性扩增;敏感性高,最低检出量为5×RID50的细胞疫苗基因组拷贝;重复性好;并且扩增效率高、线性范围广、检测时间短,可对免疫猪群中CSFV强毒感染做出快速准确的鉴别检测,为有效防制猪瘟提供依据.