小卷蛾斯氏线虫对小地老虎的侵染性试验

室内试验结果表明 ,不同温度、不同线虫剂量对小地老虎幼虫的侵染力不同 .在 2 2 - 2 7℃温度内 ,线虫侵染力最强 ;在同一温度下 ,线虫剂量越大 ,小地老虎幼虫死亡率越高 .田间试验结果表明 ,2种施放线虫方法毒饵法和浇灌法防治小地老虎效果均比喹硫磷好 ;毒饵法 (线虫剂量为 4 0 0 0 0条·株 -1)防治小地老虎的田间平均防治效果可达 6 8.53%     

昆虫病原格氏线虫与小卷蛾线虫染色体组型的研究

以格氏线虫(NC513)及小卷蛾线虫(DD-136)的幼胚、精巢及卵巢为材料,用地衣红染色、压片法制作玻片标本、对其染色体组型进行了研究,结果表明,两种线虫的染色体数目均为雌性2 N=10,雄性2 N=9。但它们的染色体组型并不一致,两种线虫的染色体组型可概括为以下公式。格氏线虫(NC513):2N=4m+6t(雌),2N=4m+5t(雄)。小卷蛾线虫(DD-136):2N=8m+2t(雌),2N=7m+2t(雄)。     

扩展莫尼茨绦虫β微管蛋白基因的克隆及序列分析

[目的]从扩展莫尼茨绦虫中克隆β微管蛋白基因,进行序列测定和生物信息学分析,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]构建扩展莫尼茨绦虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,对部分序列进行引物步移法测序,获得其全长cDNA序列;采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白二级结构的初步预测.[结果]获得了1个扩展莫尼茨绦虫新基因——β微管蛋白基因,全长1571 bp,编码444个氨基酸,与日本血吸虫的β微管蛋白氨基酸序列具有78.6;的同源性.编码蛋白的理论分子量为49.6 ku,等电点为4.96;1 -4位氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,140～146位GGGTGAG存在一个微管蛋白标志信号片段,在99～106位和391～410位存在两个典型的β微管蛋白保守区;亚细胞定位分析其为细胞的骨架蛋白.[结论]获得了扩展莫尼茨绦虫β微管蛋白基因的全长cDNA序列,为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础.     

小郑蛾斯氏线虫对小地老虎的侵染性试验

室内试验结果表明,不同温度,不同线虫剂量对小地老虎幼虫的侵染力不同,在２２－２７℃温度内,线虫侵染力最强;在同一温度下,线虫剂量越大,小地老虎幼虫死亡率越高,田间试验结果表明,２种施放线虫方法毒饵法和浇灌法防治小地老虎效果均比喹硫磷好;毒饵法（线虫剂量为４００００条．株＾－１）防治小地老虎的田间平均防治效果可达６８．５３％。     

灰飞虱β3-微管蛋白cDNA的克隆及序列分析

抽提灰飞虱RNA，利用RT—PCR技术，克隆了灰飞虱体内β3-微管蛋白基因部分序列。进一步通过3’-和5’-RACE获得了全长。序列分析表明，该基因(LSTUB3)长1859bp，编码的蛋白含454个氨基酸，分子量约为51kDa；类似于其他昆虫的β-微管蛋白，LSTUB3含有2个氨基酸保守区：NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEFTEF。另外，LSTUB3还具有1个由6个氨基酸组成的β3-微管蛋白特征性的插入序列：CASRGG。结合已发表的其他昆虫该基因的序列，构建了分子系统树，系统分析表明：LSTUB3与其他昆虫的该基因序列有较高的同源性，达85．7％以上。     

灰飞虱β3-微管蛋白 cDNA的克隆及序列分析

抽提灰飞虱 RNA,利用 RT- PCR技术,克隆了灰飞虱体内β 3-微管蛋白基因部分序列.进一步通过 3'- 和 5'- RACE获得了全长.序列分析表明,该基因 (LSTUB3) 长 1 859 bp,编码的蛋白含 454个氨基酸,分子量约为 51 kDa;类似于其他昆虫的β-微管蛋白, LSTUB3含有 2个氨基酸保守区 NNWAKGHY和 RKAFLHWYTGEGMDEMEFTEF.另外, LSTUB3还具有 1个由 6个氨基酸组成的β 3-微管蛋白特征性的插入序列 CASRGG.结合已发表的其他昆虫该基因的序列,构建了分子系统树,系统分析表明 LSTUB3与其他昆虫的该基因序列有较高的同源性,达 85.7%以上.     

小卷蛾线虫对玉米螟田间控制作用的研究

本文报道了小卷蛾线虫对玉米螟田间控制作用。结果表明，制备线虫糊剂和水剂，以每株２０００条线虫的剂量，在玉米的心叶末期和抽雄初期施用，对玉米螟的发生与危害具有较好的控制效果。当线虫施用后，线虫主要在穗上部扩散，随着时间的延长，线虫种群数量逐渐下降，但是，在第１６天仍能回收到一定数量的线虫，说明线虫的控制时间可长达１６ｄ。     

龙眼胚性愈伤组织微管蛋白基因β-tubulin克隆及序列分析

以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,利用RT．PCR法首次克隆2条含有完整开放阅读框的β-tubulin基因的cDNA序列,命名为dl-β-tubu／in3和dl-β-tubulin6,长度分别为1350和1351bp,均编码含有446个氨基酸残基的蛋白质．生物信息学分析表明,该蛋白属于亲水性蛋白,无跨膜结构域;与毛果杨、大豆、水稻、玉米和拟南芥具有较高的同源性;含有微管蛋白所特有的2个保守结构域NNWAKGH和RKAFLHWYTGEGMDEMEnE,以及1个GTP结合位点GGGTGSG．推测β-tubulin通过不同的磷酸化方式改变酶活性及蛋白构象,参与龙眼体胚发生过程的调控．     

腐烂茎线虫热激蛋白新基因的克隆与序列分析

热激蛋白90基因(heat shock protein 90 genes,hsp90s)是与生物发育、生物防御反应以及生物抗环境胁迫等相关的多功能基因.本试验以RT-PCR结合RACE方法从腐烂茎线虫Dhtylenchus destructor中克隆出1个hsp90,命名为Dd-hsp90-1,基因登录号为HQ9015...     

牧羊犬IFN-β基因的克隆和序列分析

为对犬干扰素-β(IFN-β)进行研究,用PCR技术从犬血细胞基因组DNA中扩增了牧羊犬IFN-β基因,并克隆到pGEM-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,阳性克隆经PCR和酶切鉴定后进行测序。结果表明:牧羊犬IFN-β基因含561bp,编码186个氨基酸,前21个为信号肽。成熟蛋白理论分子量为20kD,等电点为5.737,有2个潜在磷酸化位点、5个N糖基化位点和4个半胱氨酸残基,大部分为亲水区。二、三级结构预测显示,蛋白主要由5段α螺旋组成。犬IFN-β基因与赤狐的完全相同,与貉、雪貂和猫的同源性很高(85%～98.4%),在进化树中处于同一分支,而与禽类和鱼类的同源性仅为2.9%～8.6%。     

牧羊犬IFN-β3基因的克隆和序列分析

为对犬干扰索-β(IFN-β)进行研究,用PCR技术从犬血细胞基因组DNA中扩增了牧羊犬IFN-β基因,并克隆到pGEM-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,阳性克隆经PCR和酶切鉴定后进行测序.结果表明:牧羊犬IFN-β基因含561bp,编码186个氨基酸,前21个为信号肽.成熟蛋白理论分子量为20kD,等电点为5.737,有2个潜在磷酸化位点、5个N糖基化位点和4个半胱氨酸残基,大部分为亲水区.二、三级结构预测显示,蛋白主要由5段α螺旋组成.犬IFN-β基因与赤狐的完全相同,与貉、雪貂和猫的同源性很高(85％～98.4％),在进化树中处于同一分支,而与禽类和鱼类的同源性仅为2.9％～8.6％.     

桂花β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为揭示桂花不同品种β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase,HYB)基因的序列差异,利用已构建的桂花花瓣转录组数据库中Unigene序列信息,结合RT-PCR技术对桂花品种玉玲珑、金球桂、堰虹桂和日香桂中2个β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB1和HYB2)的最大阅读框进行扩增,并测序验证。生物信息学分析结果表明,4个桂花品种HYB1基因均含有长为909 bp的开放阅读框,编码302个氨基酸残基; HYB2基因均含有长为915 bp的开放阅读框,编码304个氨基酸残基。4个桂花品种HYB1和HYB2推导的氨基酸序列均具备保守的组氨酸结构域。HYB1基因核苷酸序列存在27个变异位点,其氨基酸序列存在8个变异位点; HYB2基因核苷酸序列存在12个变异位点,其氨基酸序列存在3个变异位点。进化树分析结果发现,4个桂花品种的HYB1和HYB2蛋白与茄科植物番茄和辣椒HYB蛋白亲缘性最高。     

马铃薯腐烂茎线虫14-3-3基因的克隆与序列分析

马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）是为害中国甘薯生产的主要病原物之一,由它所引起的甘薯茎线虫病,每年造成严重的经济损失。14-3-3蛋白是真核生物特有,具有高度的保守性,且在信号转导代谢调控、激素信号传导、细胞分裂和对生物和非生物刺激的应答反应等过程起到重要作用。本研究采用EST分析和RACE克隆相结合的方法,从马铃薯腐烂茎线虫中成功克隆出一个14-3-3蛋白基因（Dd-14-3-3a,GenBank accession NO.:ADW77527.1）。Dd-14-3-3a cDNA全长为986 bp,包含一个长度为756 bp的开放阅读框,编码着一个长度为251 aa的蛋白质。Blast比对结果表明：Dd-14-3-3a蛋白与已报道的南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）、大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）以及水稻干尖线虫（Alphelenchoides besseyi）中的14-3-3蛋白的一致性分别为98%、98%、98%和97%。对该蛋白结构的分析结果表明：Dd-14-3-3a蛋白包含一个典型的14-3-3蛋白结构域,且无信号肽和跨膜结构域。该基因的克隆和分析将有助于明确植物寄生线虫14-3-3蛋白在线虫侵染和与寄主互作中的作用。     

棉铃虫α-微管蛋白基因的克隆、序列分析及表达模式检测

【目的】克隆及序列分析棉铃虫（Helicoverpa armigera）α-微管蛋白基因的cDNA序列,并检测棉铃虫α、β两种微管蛋白基因的表达情况。【方法】以棉铃虫3龄幼虫为试验材料,采用RT-PCR及RACE技术克隆棉铃虫α-微管蛋白基因（HeTubA）,采用荧光定量PCR（QRT-PCR）技术分析棉铃虫α、β-微管蛋白基因在不同生长发育阶段及成虫器官中的表达模式。【结果】克隆得到棉铃虫α-微管蛋白基因（GenBank登录号为JQ069957）。序列分析表明,HeTubA开放阅读框1 353 bp,编码450个氨基酸组成的多肽,氨基酸序列包含多个α-微管蛋白保守区。与其它一些昆虫的一致性分析表明,HeTubA与八字地老虎（Xestia c-nigrum）、柑橘凤蝶（Papilio xuthus）及家蚕（Bombyx mori）的α-微管蛋白氨基酸序列同源性最高,α-微管蛋白基因在长期进化中非常保守。荧光定量PCR表明,棉铃虫α、β-微管蛋白基因不具有生长发育阶段及成虫器官特异性,且二者均在复眼表达高,腹部表达低;HeTubA在末龄幼虫期和蛹期高水平表达,HeTubB在末龄幼虫期和成虫期高水平表达。【结论】成功克隆了棉铃虫α-微管蛋白基因,对2种微管蛋白基因的表达模式进行了检测,进一步进行了蛋白质3D结构的构建,可用于深入研究2种微管蛋白基因的功能及开发新型杀虫剂。     

根结线虫rDNA-ITS片段的克隆与序列分析

用PCR方法扩增了16个不同地区和不同作物上根结线虫群体的ITS片段,并进行了克隆、序列测定分析和比对。结果表明:采自北京密云苦瓜和豇豆、北京通州月季以及山东胶州、烟台、潍坊花生上的6个根结线虫群体为北方根结线虫(Meloidogyne hapla),其ITS片段大小为772 bp;来自云南番茄、成都黄瓜和海南石榴上的3个根结线虫群体为爪哇根结线虫(M.javanica),其ITS片段大小为767 bp;来自河北廊坊番茄、北京海淀番茄和浙江黄瓜上的3个根结线虫则属于花生根结线虫(M.arenaria),其ITS片段大小为768 bp;而安徽和县、宿州的番茄以及太和桔梗上的3个根结线虫则属于南方根结线虫(M.incognita),其ITS片段大小为766 bp;海南胡椒上的根结线虫群体为番禺根结线虫(M.panyuensis),ITS片段大小为869 bp。     

椰子织蛾CSP基因的克隆与序列分析

利用rapid-amplification of cDNA ends(RACE)技术,克隆获得了1条椰子织蛾(Opisina aremosella)的全长化感蛋白基因序列。该基因全长为561 bp,开放阅读框全长为393 bp,3′和5′端非编码序列分别为48、120 bp,编码130个氨基酸,所编码蛋白质的理论分子量为14.8 ku,等电点为5.85。同源性比对分析发现,椰子织蛾化感蛋白基因氨基酸序列有4个保守半胱氨酸位点且与其他昆虫化感蛋白基因在氨基酸的水平上相似性不高。除与棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)相似度达71%外,与其他昆虫相比,均低于10%。SignalP预测显示,椰子织蛾化感蛋白基因所编码的前20个氨基酸为信号肽序列(MAMKYLIVLSCVLAAAIVAG)。系统进化树分析结果表明,椰子织蛾化感蛋白与稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和家蚕(Bombyx mori)化感蛋白1、2、3、4聚为同一族,与家蚕化感蛋白1、2、3、4的进化程度最近。这为深入研究昆虫化学感受蛋白、揭开昆虫与环境化学信息联系的规律奠定理论基础。     

梅花鹿LHβ基因的克隆及序列分析

【目的】克隆梅花鹿LHβ基因CDS区并进行序列分析。【方法】采用PCR克隆测序的方法获得梅花鹿LHβ基因CDS区全序列,采用ProtParam tool等分子生物学工具对梅花鹿LHβ蛋白的分子量、等电点、二级结构、蛋白功能等进行预测,并采用MEGA 6.0软件构建进化树以确定其系统发育地位。【结果】梅花鹿LHβ基因CDS区全长462bp(GenBank序列号为KT199365),包含了ATG起始密码子和TAA终止密码子,共编码141个氨基酸,蛋白质分子量为15.17kDa,等电点为8.00。梅花鹿LHβ蛋白均位于膜外,无跨膜结构,平均疏水性(GRAVY)为0.391,蛋白功能预测显示,该蛋白最有可能为激素,这与本研究的目的基因相符。进化树分析结果表明,梅花鹿LHβ基因与山羊、绵羊和牛等反刍动物较近,其中与绵羊最近。【结论】梅花鹿LHβ基因CDS区序列与绵羊LHβ基因最近。     

禾谷镰孢菌β-微管蛋白基因的克隆及在原核细胞中的表达

分别扩增了禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵(MBC)敏感菌株(MBCS)的β1-微管蛋白基因(β1-S)和β2-微管蛋白基因(β2-S),及多菌灵中抗菌株(MBCMR)和高抗菌株(MBCHR)的β2-微管蛋白基因(β2-MR和β2-HR),测序正确后连接到pET32a(+)原核表达载体上,转化至大肠杆菌Rosepta感受态中,经IPTG(1 mmol.L-1)诱导,得到了N末端融合6×His纯化标签的表达产物。SDS-PAGE电泳分析表明:在大肠杆菌中表达了相对分子质量约68×103的蛋白,和预测蛋白大小一致,表达的产物主要以包涵体的形式存在。表达的蛋白经HisTrapTM HP Columns纯化并做了Western-blot验证,结果表明,该蛋白能与抗His标签的单抗发生特异性反应。     

萨能奶山羊β-防御素-3基因的克隆、序列分析及差异表达

β-防御素-3(BD-3)基因在乳腺炎病程中有重要作用,目前尚未见有关山羊BD-3基因的研究报道,根据已发表的牛的BD-3基因序列的编码区(CDS)设计引物,经RT-PCR、连接T载体、挑取克隆和测序,成功克隆出长度为210bp的萨能奶山羊BD-3基因CDS区,并提交至GenBank。分析该CDS区的核苷酸和氨基酸序列,结果表明,所得核苷酸序列与牛、人的序列同源性分别为91.2%和80.9%;其氨基酸序列在萨能奶山羊BD-3蛋白的功能结构域(含23~67个氨基酸)与人的结构域同源性为99.9%,蛋白质三级结构相似。分别用热灭活的金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、大肠杆菌对乳腺上皮细胞刺激0、2、4、6、8h,观察BD-3基因的mRNA水平变化,结果显示,金黄色葡萄球菌刺激4h后,BD-3表达量达到最高,与对照组相比差异极显著(P0.01);停乳链球菌刺激后,BD-3表达量持续升高,8h时与对照组差异极显著(P0.01);大肠杆菌刺激后,BD-3表达量逐渐升高,4h时达到最高,但与对照组差异不显著,之后表达量逐渐下降。成功克隆出山羊BD-3基因,并且在金黄色葡萄球菌、停乳链球菌的刺激下有较高水平的表达,说明BD-3基因在乳腺炎病程中起到重要作用,为乳腺炎的机理研究提供借鉴。