利用正交设计优化牡丹SRAP-PCR反应体系

利用正交设计L16(45对牡丹SRAP-PCR反应体系的五因素(Taq,Mg2+,模板DNA,dNTP,引物)在四个水平上进行优化试验,得出如下结论:各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为:Tap,引物,dNTPs,Mg2+,模板DNA;筛选出各反应因素的最佳水平,建立牡丹SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:Taq酶0.5 U,Mg2+2.0 mmol/L,模板DNA 50 ng,dNTF 0.2 mmol/L,引物0.30 μmol/L.这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对牡丹进行相关研究提供了帮助.     

甜瓜SRAP-PCR体系的建立与优化

相关序列扩增多态性（sequence—related amplified polymorphism,SRAP）是基于基因的内含子和外显子区域进行检测的新型分子标记技术,具有多态性高、重复性好、便于克隆目标片段等特点,鉴于甜瓜（Cucumis melo L．）中还鲜有SRAP-PCR的相关研究报道。本研究利用L16（4^5）正交设计对甜瓜SRAP-PCR反应体系进行了优化。结果确定了10μLSRAP-PCR的最优反应体系：200ng/μL模板DNA2.5μL、10μmol／L引物0．3μL、5U／μL Toq DNA聚合酶0．6μ20mmol／L Mg^2＋ 1μL和2mmol／L dNTP 2μL。这一优化的反应体系为今后利用SRAP-PCR技术对甜瓜进行相关研究提供了帮助。     

花生SRAP-PCR反应体系的正交设计优化

本研究利用正交设计L16(45)对花生SRAP-PCR反应体系的5因素(引物,Taq酶,Mg2+,模板DNA和dNTP)在4水平上进行优化试验,结果表明,各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中引物浓度的影响最大;最佳反应体系20μL包含:引物0.4μmol/L,Taq酶1U,Mg2+2.5mmol/L,模板DNA30ng,dNTP0.2mmol/L,不足部分以ddH2O补足。这一体系的建立为今后利用SRAP标记技术对花生进行分子遗传学基础研究提供了有力的支持。     

海南油茶SRAP-PCR体系优化及有效引物筛选

海南岛为中国油茶资源分布的最南缘,海南油茶资源丰富,特色显著。本研究以海南油茶基因组DNA为模板,采用单因素试验和正交试验相结合的方法,分析DNA浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量和引物浓度对海南油茶SRAP-PCR扩增结果的影响,构建海南油茶SRAP-PCR体系,对多态性引物组合进行筛选,为SRAP分子标记在海南油茶资源遗传多样性评价和鉴定提供条件。单因素试验结果表明:在本试验中,海南油茶基因组DNA浓度高低对扩增效率影响不大,低浓度dNTPs有利于获得较好的扩增产物,而中高浓度的Taq酶和引物可提高扩增效果。正交试验结果表明:在适宜浓度范围内,各因素对海南油茶SRAP-PCR扩增影响大小依次为:引物>dNTPs>Taq DNA聚合酶>模板DNA;总体系为20μL时,最佳反应体系中模板DNA用量为5 ng,dNTPs浓度为0.20 mmol/L,引物浓度为0.60μmol/L以及Taq DNA聚合酶用量为4.00 U。采用稳定SRAP-PCR体系,对400对SRAP引物进行筛选,获得32对多态性好、条带清晰的有效引物,可用于海南油茶遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究。     

正交设计优化青蒿SRAP-PCR反应体系及引物筛选

为了建立青蒿的SRAP最佳扩增体系,并筛选出SRAP多态性引物,本研究以青蒿叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2+、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板5种因素5个水平,对青蒿SRAP反应体系进行研究。结果表明,青蒿SRAP-PCR最佳反应体系为:引物0.6μmol/L、Mg^2+2.0 mmol/L、模板DNA 5.1 ng、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs 0.25 mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应均有不同影响,其中引物浓度的影响最大,dNTPs的影响最小。运用该体系对不同种质资源的青蒿进行验证,证明该体系稳定可靠,并在30个引物组合中筛选出了25对扩增条带清晰,多态性丰富的引物组合。这一结论为今后利用SRAP标记技术进行青蒿分子遗传学研究提供了科学依据。     

短芒披碱草SRAP-PCR 体系的建立和优化

通过单因子和正交设计两种试验方法,对短芒披碱草SRAP-PCR体系进行优化,得到短芒披碱草20μL SRAP-PCR最优反应体系为：Mg2＋2.00 mmol/L、引物0.40μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U、d NTPs250μmol/L、DNA 30 ng和10×buffer 2μL;各因素水平变化对PCR反应影响从大到小依次是：Mg2＋、引物、Taq酶、d NTPs和模板DNA。运用该优化体系对6份短芒披碱草材料进行验证,电泳结果显示扩增条带多态性高,清晰无杂带。该优化体系的建立有助于将SRAP标记技术用于短芒披碱草的遗传育种等研究。     

应用正交设计建立芍药的SRAP反应体系

为快速建立优化的芍药SRAP扩增反应体系,应用L25(56)正交表,研究了Taq、Mg2+、随机引物、dNTPs和DNA模板5种反应组分的浓度变化对SRAP扩增结果的影响,直观分析和稳定性检测结果表明:正交设计可高效建立优化稳定的芍药SRAP反应体系;用该法建立的芍药SRAP-PCR优化反应体系为:25μL反应体系中含10×PCR Buffer(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3,500 mmol/L KCl)2.5μL,MgCl22.5 mmol/L,dNTP各0.25 mmol/L,引物各0.3μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,DNA模板120 ng。     

鹧鸪茶SRAP-PCR反应体系优化技术

为了更好地应用SRAP分子标记技术于鹧鸪茶遗传多样性研究中,本研究采用单因子试验和正交试验相结合的方法对鹧鸪茶SRAP-PCR反应体系中的主要影响因子进行优化,先利用单因素试验找到各因子的适宜浓度范围,再采用L_(160(4~4)正交表进行正交试验,按照遗传多样性分析的要求,直观分析16个试验组合间的扩增效果,从中构建出了一套重复性好、条带清晰且稳定的SRAP-PCR体系:在20μL体系中,10×PCR Buffer 2μL,Taq DNA聚合酶3 U,d NTPs 0.15 mmol/L,引物浓度0.4μmo l/L和模板DNA 40 ng。经检验,该优化体系可适用于鹧鸪茶种质资源SRAP分析的PCR反应条件和反应程序,也可应用于鹧鸪茶不同居群间的亲缘关系和遗传多样性分析。     

利用正交设计优化烟草SRAP反应体系

利用正交设计L16(45)对烟草SRAP-PCR反应体系的五因素(Taq酶,Mg2 模板DNA,dNTP,引物)在四个水平上进行优化试验,PCR结果用统计软件SPSS V13.0分析,得出如下结论:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Taq酶量影响最大;筛选出各反应因素的最佳水平,建立烟草SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:Taq酶1.0 U,Mg2 1.5 mmol/L,模板DNA 30.00～120.00 ng,dNTP0.1 mmol/L,引物0.40 μmol/L.最后,应用烟草SRAP-PCR最佳反应体系对PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了筛选,得出SRAP-PCR扩增以52℃退火温度、35个循环次数为最佳.这一优化系统的建立为今后利用SRAP标记技术对烟草进行基础研究提供了一个标准化的程序.     

大蒜ISSR-PCR反应体系的正交优化建立

为探寻出更适宜大蒜的ISSR反应体系,以‘弥渡紫皮’大蒜为试材,对ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素（dNTPs、Taq酶、Mg2+、引物浓度、模板DNA）在4个不同水平上进行正交设计L16(45)优化。结果表明,含10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol Mg2+、0.15 mmol dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.4 μmol引物、20 ng/μL模扳DNA的25 μL反应体系为大蒜的最佳反应体系。利用新建立的反应体系对20个不同大蒜品种进行扩增,具有极好的稳定性和重复性。     

番石榴SRAP反应体系的建立与正交优化

采用正交设计方法,对影响番石榴SRAP反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA浓度等进行了优化,建立了适用于番石榴的SRAP反应体系。该优化的20 μL反应体系中包含2.5 mmol/L Mg2+,0.15 mmol/L dNTPs,0.4 μmol/L引物,1.5 U Taq DNA聚合酶和20 ng模板DNA。利用该优化体系通过64对SRAP引物组合对5份番石榴材料进行了SRAP-PCR扩增,结果表明SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于番石榴种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究。     

仁用杏ISSR分析体系的正交优化

本研究以仁用杏丰仁为试材,采用经改良的CTAB法提取实验材料幼叶基因组DNA.利用正交设计法,从Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq/DNA聚合酶及模板DNA用最5种因素4水平出发,构建和优化仁用杏ISSR-PCR反应体系,并采用直观分析和方差分析相结合的方法分析正交实验结果,最终建立了仁用杏ISSR-PCR最佳反应体系总体积20μL:1.5 U Taw DNA聚合酶、2.0 mmol/L MgCl_2、0.15 mmol/L dNTPs、0.35μmol/L引物、30～60 ng模板DNA.在优化体系的基础上筛选出 13个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定每个引物的最适退火温度.经对最佳反应体系和程序进行了验证,结果显示该体系具有扩增稳定性.     

仙茅属植物SRAP-PCR反应体系的优化

通过单因子和双因子实验对仙茅属植物SRAP-PCR反应体系中主要成分(Mg2 、dNTP、引物、模板和Taq DNA聚合酶)进行优化,并比较了琼脂糖凝胶电泳与非变性PAGE电泳的检测效果.建立了适合仙茅属植物SRAP分析的反应体系:25 μL体系中内含1×PCR buffer、2.0 mmol/L Mg2 、250 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、40 ng模板、1 U Taq酶.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率较高且带型清晰,能更准确反映仙茅属植物间的差异.优化的反应体系可以用于仙茅属植物的SRAP分析.     

正交设计优化扁蓿豆ISSR反应体系的研究

以扁蓿豆(Medicago ruthenica)为试材,采用改良的CTAB法提取DNA,利用正交设计L16(45)探讨10×PCRBuffer(含Mg2+)、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量对扁蓿豆ISSR-PCR反应的影响,正交试验的结果采用直观分析和方差分析相结合。建立了扁蓿豆的ISSR-PCR优化反应体系,在25μL反应体系中,TaqDNA聚合酶1.5U,10×PCR Buffer(含Mg2+)2.0 mmol/L,模板DNA0.5 ng/μL,dNTPs 0.6 mmol/L,引物0.9μmol/L。同时探讨引物HZD09211的最适退火温度为52.3℃。2个不同引物对20份扁蓿豆材料DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示该体系具有较高的稳定性。