思茅松毛虫肠道脂肪酶高产菌株的筛选及其酶特性研究

从思茅松毛虫幼虫肠道中分离出3属7株产脂肪酶菌,以思茅松松节油为底物,筛选高产脂肪酶菌株,测定脂肪酶活性,确定酶解特性,生长量和产酶特性。结果表明:以思茅松松节油和橄榄油为底物时,7株产脂肪酶菌均表现出不同的产脂肪酶活性,其中以菌株D12的产脂肪酶活性最高。以思茅松松节油为底物时,菌株D12的脂肪酶活力高达4.06 U·mL-1;菌株D12为中温型产碱性脂肪酶菌株,最适作用温度40℃,最适pH值为8.0;菌株D12经发酵至60 h时,OD600值高达0.68,说明其生长量达到最大,在48 h左右时酶活力达到最高,为6.6 U·mL-1。     

米黑根毛霉脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达及酶学性质研究

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用偏爱性,对米黑根毛霉脂肪酶(RML)成熟肽基因进行全面密码子优化,以提高RML基因在酵母细胞中表达的水平,并对重组脂肪酶的酶学性质进行了研究。运用重叠延伸PCR合成优化后的RML成熟肽基因,并进一步构建毕赤酵母表达载体p PIC9K-RML,通过电击法转化毕赤酵母GS115菌株,经G418抗性和PCR筛选获得高拷贝转化重组子。重组酵母菌用0.5%甲醇诱导异源基因表达,在28℃摇瓶培养168 h后酶活力达到122 U/m L,较未优化的原始菌株的表达酶活提高了10倍。重组脂肪酶最适温度为45℃,最适p H值为7,甲醇体积分数为40%以下时重组RML具有较好的稳定性。     

响应面法优化芽孢杆菌产脂肪酶发酵条件

通过单因素试验、Plackett-Burrman设计及响应面法对芽孢杆菌T3—4的产脂肪酶条件进行优化。确定最适C、N源分别为麦芽糖、蛋白胨+硫酸铵,碳氮比为1∶3。其最适产酶条件为:七水硫酸镁0.05%,蓖麻油1.5%,蛋白胨0.75%,磷酸氢二钾0.1%,麦芽糖0.5%,硫酸铵0.3%,pH值6.5,接种量10%。在此条件下,发酵脂肪酶活力可达805.836 U/mL。     

产漆酶半知真菌Myrothecium verrucaria NF-08菌株的分离及产酶研究

[目的]采集凉水国家级自然保护区原始森林土壤样品,分离产漆酶真菌并优化产酶条件,旨在开发产漆酶半知真菌种质资源,提高漆酶产量,为微生物漆酶扩大生产提供菌种资源和条件参数.[方法]以木质素磺酸钠为唯一碳源的无机盐培养基为富集培养基,在愈创木酚-PDA选择性平板上分离产漆酶真菌.利用ABTS[2,2 ′-连氮一双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]和SGZ [4-羟基-3,5-二甲氧基一苯甲醛连氮,即丁香醛联氮]显色反应初筛和摇瓶发酵复筛.确定供试菌株后,利用形态观察结合rDNA-ITS序列分析技术,将菌株鉴定至种.以ABTS法测定供试菌发酵液漆酶活性,以Lowry法测定发酵液总蛋白含量.在考察供试菌株生长、产酶及胞外蛋白总量动态变化基础上,通过单因素试验,研究碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、培养基起始pH、装液量、接种量及底物诱导对菌株产漆酶的影响,获得菌株产酶最适培养基组分和培养条件参数.[结果]获得1株发酵周期短、初始酶活高的产酶菌株NF-08.结合形态学特征与rDNA-ITS序列分析结果,鉴定菌株NF-08属于为半知菌亚门疣孢漆斑菌.该菌株在液体发酵培养基中产漆酶活性与菌丝生长和胞外蛋白总量基本同步,发酵第6天达到酶活峰值9.28 U·mL-1.疣孢漆斑菌NF-08产酶最佳碳、氮源分别为4.0％葡萄糖和3.5％蛋白胨,培养基初始pH7.0.最适装液量60 mL·(250 mL)-1,最适接种量4％,最适培养温度和摇床转速分别为30℃和140 r·min-1.没食子酸、阿魏酸和单宁酸显著诱导疣孢漆斑菌NF-08漆酶活性的产生,以没食子酸效果最好.经过培养基组分和培养条件优化以及底物诱导,疣孢漆斑菌NF-08产酶水平达到16.82 U·mL-1,比优化前提高了81.25％.[结论]建立环境样品中产漆酶真菌的分离、纯化及筛选方法,获得了一株发酵周期短、产漆酶活力高的半知真菌疣孢漆斑菌NF-08.该菌株经单因素试验产酶条件优化效果明显,酶活水平提高显著,可为微生物发酵产漆酶提供新的菌株资源,在微生物发酵漆酶工业生产中具有应用潜力.后续对疣孢漆斑菌NF-08漆酶产生、性质及基因表达调控的深入研究,将有助于了解漆酶在半知真菌生活史中的作用及生态学功能,同时拓展半知真菌漆酶的应用领域.     

产维素酶菌株SB-4的理化特性及产酶条件优化

以纤维素酶产生菌SB-4为实验材料,通过对其菌落形态和菌丝及孢子显微镜观察,结合培养特征和生理生化分析,探究其理化特性及产酶最优条件。结果表明:SB-4菌株能缓慢胨化牛奶、水解淀粉、产生硫化氢和黑色素,革兰氏染色为阳性,初步鉴定其为放线菌节杆菌属。通过对发酵条件的优化,确定SB-4产酶发酵最适单一氮源为酵母膏,最适单一碳源为羧甲基纤维素钠碳源,装液量为200 m L/500 m L,发酵时间为72 h,在此条件下SB-4菌株的内切葡聚糖酶(CMC)、滤纸酶(FPA)和β-葡萄糖苷酶(Cx)酶活性分别为47.09 U/m L、41.81 U/m L和28.62 U/m L。     

高产漆酶真菌菌株的筛选及酶学性质研究

从6株野生真菌和5株食用真菌中筛选出高产漆酶菌株,并对筛选出的野生菌株漆酶酶学性质进行初步探究。使用G-PDA确定菌株的产漆酶能力,然后通过液体发酵对产生的粗酶液进行酶活力测定,确定高产漆酶菌株,最后分别在不同pH和温度下进行酶学性质探究。初步筛选结果:第7天时,05号菌丝直径最大89.1mm,08号显色圈直径最大76.8mm,04号的显色圈颜色最深,09号显色反应最不明显。对于漆酶活力:04号活力最高262.7U/mL,其次是08号和05号分别为255.3U/mL、203.9U/mL。01和06号酶活力达到最大所需时间最短。酶学性质方面,08号的最适pH是3.2、最适温度是40℃;在不同pH、温度下分别保温2h,pH=4.0酶活力残余率为94.20%;温度在20~40℃内,酶活力残余率在99.00%以上。结果表明,0.04%G-PDA最适作为产漆酶真菌的初筛培养基;高产漆酶能力的菌株有04、05和08号菌株,且08号菌株漆酶的最适应用条件是pH=4.0、温度为40℃。     

没食子单宁降解菌株的筛选及发酵条件优化

通过平板涂布、划线分离、菌落观察等方法,从土耳其倍子提取液自然生长的菌落中分离纯化出11株菌,从中初筛出1#、2#、4#这3株降解没食子单宁的菌株,复筛出1株没食子单宁优良降解菌株1#菌,其没食子单宁降解率达65%以上,发酵液中没食子酸质量浓度为0.052 3 g/L,单宁酶活为0.920 U/mL;对1#菌株的发酵条件进行了响应面法优化,结果表明:1#菌最佳产酶条件为培养温度31℃,初始培养基pH值5.0,最适培养时间50 h,在该条件下1#菌单宁酶酶活可达1.170 U/mL,与优化前的最大酶活0.920 U/mL相比,提高了27.2%。     

黑曲霉发酵豆渣产酸性β-葡萄糖苷酶及其水解京尼平苷的性质

利用单因素、正交试验考察了黑曲霉L菌株发酵豆渣产β-葡萄糖苷酶的条件和酶解京尼平苷的特性。结果表明:2%豆渣适宜作为实验菌株液体发酵产酶培养基,当培养基中接种孢子浓度大于每毫升2×105个时,菌株产酶受发酵温度、装液量的影响显著,而不受接种量、摇床转速的影响,培养基初始pH值1.5时,菌株仍能正常产酶;优化的产酶培养基组成为豆渣1%、米糠1%和Tween 800.1%,初始pH值5.5;菌株在发酵温度28℃、装液量50 mL(250 mL摇瓶)、摇床转速150 r/min的发酵条件下发酵120 h,发酵液酶活为(200±10)U/mL。所产β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷的最适温度为55℃、最适pH值2.5、最佳水解时间15 min;在该条件下酶的表观米氏常数(Km)为1.35 g/L,最大水解速率(Vmax)为26.45 g/(L.min.mg),酶活半衰期为15 min,50℃时大于60 min;酶的水解活性受Na+、Ca2+的显著激活,受Mg2+、Ba2+、Cu2+、Fe2+、Hg+、Zn2+、Mn2+等离子(10 mmol/L)和葡萄糖、乙醇的抑制。     

制备生物柴油用脂肪酶产生菌的诱变和筛选

以提高全细胞生物催化制备生物柴油的效率为目的,采用紫外诱变的方法对产脂肪酶的米根霉菌株进行诱变和筛选。筛选得到的诱变株命名为LY6,脂肪酶水解酶活(4.33 U/mL)是原始菌株的4.33倍,合成酶活(0.28 U/mL)是原始菌株的1.12倍,脂肪酶水解酶最适反应pH值为7.0。将筛选得到的菌株制备成固定化全细胞生物催化剂催化大豆油转酯化制备生物柴油,在醇油比为3∶1(物质的量之比,下同)时,脂肪酸甲酯得率比原始菌株提高了41.0%,达到87.3%;在醇油比为4∶1时,最终生物柴油的甲酯得率比原始菌株提高了16.8%,达到96.1%,故经筛选得到的菌株能作为全细胞生物催化制备生物柴油的优良菌株。     

N~+注入诱变黑曲霉选育单宁酶生产菌株

以黑曲霉为出发菌株,经多次N+注入诱变,得到突变高产单宁酶菌株黑曲霉ANO2。该突变菌株其产单宁酶酶活为670.2 U/mL,较出发菌株的单宁酶酶活442.3 U/mL提高51.4%以上,突变菌株经传10代培养,产酶特性稳定,是一株比较理想的单宁酶生产菌株。