甘薯羽状斑驳病毒和褪绿矮化病毒双重 RT-PCR 检测方法的建立

根据 GenBank 中公布的甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）外壳蛋白（CP ）基因和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）热激蛋白（Hsp70）基因序列保守区域设计了2对特异性引物,通过 RT-PCR 反应程序的优化,建立了能同时检测 SPFMV 和 SPCSV 的双重 PCR检测体系。该检测体系能够1次扩增出 SPFMV 和 SPCSV 的特异性片段,片段大小为461 bp 和304 bp,测序结果表明,2种病毒序列与参考序列的同源性达93％以上。     

甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和矮化退绿病毒(SPCSV)的双重RT-PCR检测技术体系构建

在大田生产中,甘薯极易受到甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)和甘薯矮化退绿病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的混合侵染,导致甘薯产量和品质严重下降,因此构建能同时检测SPFMV和SPCSV两种病毒的检测技术体系对甘薯病毒病(sweet potato virus disease,SPVD)的预防具有重要意义。RT-PCR病毒检测技术具有灵敏度高、特异性强的优点。针对SPFMV和SPCSV病毒分别设计4对和3对特异性引物,通过单一RT-PCR检测技术筛选出特异性强的引物和最佳退火温度;在双重RT-PCR检测体系中,针对SPFMV和SPCSV两种病毒的引物浓度组合设置5个处理,优化双重RT-PCR病毒检测技术体系。单一RT-PCR检测结果表明,SPFMVS2/A2和SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为461bp,对于SPCSV病毒来说,SPCSVS2/A2引物的特异性最强,目的片段大小为304bp,最佳退火温度为56℃;在双重RT-PCR检测技术体系中,SPFMV/SPCSV的引物组合浓度比为1∶3时,目标片段扩增效果最好。对两种病毒最低检测浓度的测试结果表明,SPFMV和SPCSV两种病毒RNA的最低检测浓度相当于模板RNA浓度的10-4μL。双重RT-PCR检测技术体系的构建,为大田生产中受SPFMV和SPCSV共侵染的甘薯病毒病的预防提供技术支持。     

甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】甘薯病毒病（sweet potato virus disease, SPVD）是甘薯上的毁灭性病害之一,严重时可造成90%以上的产量损失。论文旨在对甘薯SPVD染病植株中甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV）2种病毒的复合侵染情况进行研究,建立SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD的早期预警和流行学研究提供技术手段。【方法】选取重庆地区具有不同SPVD典型症状的甘薯品种（系）叶片作为试验材料,对其进行症状和SPFMV、SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附（NCM-ELISA）检测;对供试材料叶片中的SPFMV外壳蛋白CP和SPCSV热激蛋白HSP70核苷酸序列进行克隆和序列分析,根据保守核苷酸序列设计荧光定量RT-PCR检测引物。以甘薯泛素（ubiquitin,UBI）和组蛋白（histone,H2B）编码基因为内参对供试样品进行荧光定量RT-PCR检测,与感染SPVD典型症状和NCM-ELISA检测结果进行比较,并对取自不同甘薯品种(系)、相同品种(系)不同单株以及相同植株不同部位叶片检测结果进行比较,筛选可快速、精确、定量检测SPVD的荧光定量RT-PCR检测方法。【结果】症状学诊断表明不同甘薯品种（系）的感病叶片可能表现出不同的典型症状特点,同一品种（系）的不同感病植株感病症状相似但也存在差异。序列分析结果表明供试材料中SPFMV至少存在2个株系类型(RC和EA),SPCSV至少存在1个株系类型（WA）。在15份供试材料中,10份材料由NCM-ELISA和荧光定量RT-PCR均检测到SPFMV和SPCSV的共同感染,且荧光定量RT-PCR检测结果与发病症状和NCM-ELISA检测结果相吻合,其检测结果可准确反映甘薯SPVD染病植株中2种病毒复合侵染情况。荧光定量RT-PCR检测结果还表明,不同品种(系)或相同品种(系)不同单株病叶中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平存在差异;相同植株顶端幼嫩叶片和中部成熟叶片中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平也存在差异。染病材料中SPFMV中CP转录水平均相对较高,是SPCSV的HSP70转录水平的3-556倍。4份材料经NCM-ELISA检测只有SPFMV而没有SPCSV感染,而荧光定量RT-PCR还可检测到其中2份材料中SPCSV HSP70转录水平,说明这2份材料中也存在SPFMV和SPCSV的共同感染,表明荧光定量RT-PCR比NCM-ELISA检测结果更灵敏、准确。【结论】 筛选出可利用SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平进行检测的荧光定量RT-PCR检测引物,建立了SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD针对性地监测预警提供了极为有效的方法。在建立甘薯SPVD防御体系时,需综合考虑2种甘薯病毒的共侵染特性和甘薯品种差异,采取针对性的监测和预警机制。     

甘薯病毒病发生关键因素研究

【目的】 明确甘薯种薯携带的病毒种类与苗期病毒病发生率和严重度之间的关系,以及甘薯田烟粉虱发生量和带毒率与种薯带毒率之间的关系,建立甘薯苗期病毒病预测预报方法和种薯质量早期预警技术,为甘薯无病毒种薯生产和病毒病防控提供理论依据。【方法】 利用PCR和RT-PCR方法对随机采集的不同来源的甘薯种薯进行病毒检测,检测的病毒种类包括马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的甘薯羽状斑驳病毒（sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）、甘薯病毒C（sweet potato virus C,SPVC）、甘薯病毒G（sweet potato virus G,SPVG）、甘薯潜隐病毒（sweet potato latent virus,SPLV）和甘薯病毒2（sweet potato virus 2,SPV2）,毛形病毒属（Crinivirus）的甘薯褪绿矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）和黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus,CMV）以及甘薯双生病毒（sweepoviruses）等我国甘薯上常见的8类主要病毒。然后对检测的种薯进行育苗,出苗后调查薯苗的发病情况,分析种薯携带的病毒种类与苗期病害严重度之间的关系。2018年和2019年分别在河南、宁夏和陕西等地设置试验点,种植背景相同的甘薯品种商薯19原原种苗和脱毒试管苗,在甘薯生长期,采用黄板诱虫法调查各试验点烟粉虱发生量并采集烟粉虱活体,检测烟粉虱SPCSV带毒率。种薯收获后,随机取样对种薯SPCSV带毒率进行检测,分析甘薯田烟粉虱发生量和带毒率对种薯带毒的影响。【结果】 在检测的665块甘薯种薯中,有463块种薯携带病毒,育苗后有333块种薯的薯苗表现出叶片黄化、明脉、皱缩和植株矮化等病毒病症状。当种薯携带一种或多种马铃薯Y病毒属病毒时,薯苗病毒病症状主要为0—1级（其中,0级占60.6%;1级占31.8%）;当种薯携带甘薯双生病毒或甘薯双生病毒与马铃薯Y病毒属病毒的组合时, 薯苗病毒病症状主要为0—1级（其中,0级占55.3%;1级占32.9%）;当种薯携带SPCSV时,苗期病毒病症状显著加重,特别是当种薯同时携带SPCSV与马铃薯Y病毒属病毒时,薯苗显症率为100.0%,症状主要为3—9级（其中,3级和5级占49.0%、7级和9级占51.0%）。连续2年田间试验结果表明,甘薯田烟粉虱发生量和带毒率与种薯带毒率密切相关,回归方程为Y=9.628X₁+0.008X₂+6.537,R²=0.914,其中,Y为种薯SPCSV的带毒率,X₁为烟粉虱带毒率,X₂为烟粉虱发生量。【结论】 种薯携带SPCSV是苗期病毒病严重发生的关键因素,当种薯同时携带SPCSV与马铃薯Y病毒属病毒时,薯苗病毒病显症率和严重度显著增加。甘薯田烟粉虱发生量和SPCSV带毒率与种薯带毒率密切相关,烟粉虱是影响种薯携带SPCSV的关键因素。     

反向斑点杂交法快速检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯G病毒

[目的]以克隆得到的甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）和甘薯G病毒（Sweetpotato virusG,SPVG）基因片段为探针建立反向斑点杂交技术体系,应用于甘薯组培脱毒苗带毒情况检测,为生产优质甘薯组培脱毒苗提供保障.[方法]根据已公布的侵染甘薯的SPFMV和SPVG的核苷酸序列设计两对特异引物,以RT-PCR法从染病的甘薯叶片扩增SPFMV和SPVG的两个片段,并以克隆到的两个病毒片段及内参基因Actin片段为探针建立反向斑点杂交体系.[结果]分别克隆出长度约310和500 bp的片段,经BLAST比对,所获得的310 bp片段为SPFMV的外壳蛋白基因片段,同源性为97％,500 bp片段为SPVG的外壳蛋白基因片段,同源性为99％.分别用带有SPFMV和SPVG片段的重组质粒pUC-SPFMV和pUC-SPVG进行反向斑点杂交,发现不同病毒能获得单一信号,无交叉现象.以染病甘薯和脱毒甘薯苗为样品,用该种病毒的探针进行反向斑点杂交,染病植株样品中能获得单一信号,而脱毒苗甘薯样品未见任何信号,杂交结果与RT-PCR检测结果一致.[结论]用建立的反向斑点杂交技术体系能有效检测甘薯中的SPFMV和SPVG,无交叉信号,可用于甘薯组培脱毒苗的前期检测.     

甘薯卷叶病毒的RPA检测方法的建立

【目的】建立快速检测甘薯卷叶病毒重组酶聚合酶(RPA)等温扩增方法,为甘薯卷叶病毒(sweet potato leaf curl virus,SPLCV)提供快速、简便的检测方法。【方法】根据甘薯卷叶病毒AV1基因的保守区段设计RPA检测用引物,并对引物进行筛选,对反应条件和反应体系进行优化,建立SPLCV的RPA检测方法。【结果】建立的甘薯卷叶病毒RPA方法快速简便,39℃反应20 min完成检测;灵敏度高,最低检测限为10 pg·μL~(-1);特异性强,与感染番茄黄化卷叶病毒(TYLCD),甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯G病毒(SPVG)、甘薯退绿矮化病毒(SPCSV)等4种DNA病毒均无交叉反应。【结论】建立的RPA检测方法具有快速、灵敏、特异性强、不需要特殊仪器等优点,适合田间甘薯卷叶病毒样品的快速检测。     

甘薯病毒病原相关的microRNA的挖掘及分析

【目的】甘薯的病毒种类比较多,不同的病毒感染会引起相应的症状变化,田间自然发病的甘薯表型不一,这可能与病毒感染类型有关。论文旨在鉴定和研究甘薯中与不同甘薯病毒感染相关的microRNA（miRNA）。【方法】采用Illumina公司高通量测序技术,对来自福建泉州地区同一品种（龙薯9号）、具有不同症状的叶片样本（畸形黄化、疱疹、褪绿矮化和曲叶,样本编号分别为Fj01、Fj02、Fj03和1H）进行高通量测序,利用生物信息学手段挖掘和分析差异表达miRNA,并对差异miRNA和病毒表达进行PCR验证,鉴定基因和病毒在样本中表达情况,分析测序数据的可靠性,利用生物信息学分析进行miRNA靶基因预测和功能分析,探究差异miRNA与病毒种类的相关性。【结果】通过与病毒数据库的比对,发现Fj01、Fj02、Fj03样本（除1H外）均感染了甘薯常见病毒,如甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）、甘薯病毒2号（Sweet potato virus 2,SPV2）、甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）、甘薯G病毒（Sweet potato virus G,SPVG）、甘薯C病毒（Sweet potato virus C,SPVC）等,但Fj01、Fj02和Fj03这3个样本的症状并不一致,样本之间只在甘薯不常见的病毒种类中有差异,通过PCR验证了SPFMV和SPVC病毒在样本中的表达情况与测序数据基本一致。在4个样本中共鉴定出679个已知的miRNA和1 004个新的miRNA,通过配对比较分析,其中288个已知的miRNA和433个新的miRNA在4个样本之间有差异性表达,并且这些miRNAs,如miR-156、miR-157、miR-166等家族的成员在4个样本中表达模式各异。同时,采用实时荧光定量PCR验证几个差异miRNAs（如miR-156、novel-miR-40和miR-319m）在各个样本间的表达情况与测序结果基本一致,另外,与脱毒苗样本进行比较,检测到3个miRNA（miR-160a、miR-2096和miR-5387b）在4个症状样本中具有不同程度的上调表达,证明miRNA的表达与植株的表型有关。通过对miRNA靶基因的预测与分析,发现这些差异miRNA的靶基因多数为转录调控因子,编码蛋白多含有ZFP、WD、Myb、SPL等功能区域,这些因子多参与调控植物的基因、代谢通路和抗原识别等来调控植物生长发育、形态建成和抗逆性,表明这些miRNA靶基因的功能多样性。【结论】不同病毒感染确实能够引起miRNA差异表达,并且这些miRNA通过其靶基因参与调控植物的生长发育、抗胁迫性和防御。     

甘薯RAPD-PCR反应条件的优化

以徐薯22的基因组DNA作为PCR反应模板,以随机引物进行RAPD-PCR反应,通过设置ToqDNA聚合酶加量、MgCl2 浓度、dNTPs 浓度、模板DNA加量、引物加量的不同梯度,探索出一套适合甘薯RAPD-PCR的最优反应条件.试验结果表明,最优反应条件为反应体系25.0μL,2.5μL的PCR 10xBuffer、0.15U 的Taq DNA 聚合酶、3.0 nmol·μL-1的MgCl2、0.6 nmol·μL-1的dNTPs、40 ng的DNA模板、40 ng的RAPD引物.     

甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)生物学性状研究

经 1996～ 1999年研究 ,明确了侵染甘薯的甘薯羽状斑驳病毒 (SPFMV)的失毒温度为 6 0～ 6 5℃ ,稀释限点为 10 -3 ～ 10 -4 ,体外保毒期为 1天 ,用 2 3种植物测定表明 ,SPFMV侵染普通牵牛和巴西牵牛 ;桃蚜、棉蚜、豆蚜、绣线菊蚜均为SPFMV传毒介体 ,白粉虱不传。免疫电镜观察 ,SPFMV质粒线条状 ,长度 830～ 85 0nm。制备的SPFMV抗血清效价为 1∶10 2 4。     

甘薯病毒病检测技术研究进展

简要概述了侵染甘薯的羽状斑驳病毒(SPFMV)、潜隐病毒(SPLV)、轻斑驳病毒(SPFMMV)、退绿矮缩病毒(SPCSV)、脉花叶病毒(SPVMV)等10余种病毒种类;着重综述了检测甘薯病毒常用的生物学、血清学、分子生物学等几种主要检测技术的原理和特点。生物学方法是依据病毒侵染后在甘薯或指示植物上的外观症状进行识别,但检测速度慢,易受季节限制;血清学技术是利用病毒外壳蛋白的抗原性,据特异性的抗体抗原免疫学反应检测病毒存在,但制备抗血清需时间长,对含量少和无蛋白外壳的病毒无法检测;分子生物学方法是以核酸为基础,通过检测病毒核酸来证实病毒的存在,该技术具有灵敏度高、特异性强、适应范围广等特点。     

松阿扁叶蜂SSR-PCR反应体系的优化

以SDS-蛋白酶K法提取的松阿扁叶蜂(Acantholyda posticalis Matsumura)基因组DNA为模板,利用L16(45)正交设计对影响松阿扁叶蜂SSR-PCR反应的主要参数DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物和dNTPs进行优化.结果表明,松阿扁叶蜂SSR-PCR最优的反应体系为25 μL体系中含1.00U Taq DNA 聚合酶、3.00 mmol/L Mg2+、3.75 mmol/L dNTPs、25.00 ng/μL DNA模板和10.00 μmol/L引物.     

甘薯ISSR-PCR反应体系的优化

为进一步利用ISSR-PCR标记技术研究甘薯种质资源的遗传多样性,针对影响ISSR-PCR反应体系的5个影响因子(模板、甲酰胺、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶)进行了甘薯ISSR-PCR体系优化的正交试验设计研究.结果表明,处理10为比较好的组合,即在20 μL的反应体系中,含稀释浓度为10倍的DNA模板,0.30 mmol/L dNTP,1.00 μmol/L引物,1.00 UTaq酶,0.5%去离子甲酰胺比较适合甘薯DNA的特异扩增.     

沙棘SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的SRAP-PCR反应体系,对影响SRAP-PCR的Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、模板DNA浓度进行了优化.优化后的反应体系为Mg2+3.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶2U/25μL、引物0.8 μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、模板DNA 30ng/25μL,反应总体系25 μL.利用此体系从30对引物组合中筛选出17对适合沙棘SRAP-PCR的引物,有助于沙棘的分子标记辅助育种研究.     

甘薯羽状斑驳病毒分离物的基因组3’—末端序列测定与分析

采用马铃薯Y病毒属通用引物，从甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)山东济南分离物和浙江杭州分离物基因组3’-末端扩增到一个含1814个核苷酸的序列，序列号分别为AJ310201和AJ310202。两个序列均包括NIb基因部分序列(nts 1-645)、外壳蛋白基因(nts 646-1590)和3’-UIR(nts 1594-1814)，3’-末端具有典型的poly(A)尾。外壳蛋白基因核苷酸系统进化树分析和氨基酸分析表明，以前对一些SPFMV分离物的命名有待商榷，一些相关性较强的分离物可分为3个进化主要群体，我国两个分离物属于第二群体。     

山核桃干腐病菌环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测体系的建立

为了建立一种能够快速、准确、高效地检测山核桃干腐病菌的技术,本研究根据茶藨子葡萄座腔菌的β-tubulin基因序列设计外引物、内引物和环引物,并对扩增体系和条件进行了优化、并分析其特异性和灵敏度。结果使用羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,反应体系(Bst DNA聚合酶0.16U/μL,外引物F3和B3均为0.2μmol/L,内引物FIP和BIP均为1.6μmol/L,环引物LB为0.8μmol/L,Mg~(2+)为4 mmol/L,dNTP为1mmol/L,甜菜碱Betaine为0.6mmol/L)在等温(64℃)条件下反应1h能特异性检测山核桃干腐病菌:以山核桃干腐病菌DNA为模板的反应液呈阳性(变为蓝色),而其余的病菌均为阴性(仍为紫色),该技术的最低检测限为1pg/μL。     

番鸭呼肠孤病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立

为实现番鸭呼肠孤病毒的快速检测,本研究根据Gen Bank中公布的番鸭呼肠孤病毒σC蛋白基因的高度保守序列设计了4条引物,通过优化反应体系中各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。然后以鸭常见病毒基因组为模板,开展特异性检测,最后通过添加SYBR Green I荧光染料完成可视化LAMP检测方法的建立。结果显示:25μl LAMP反应体系,镁离子5×10-5mmol,d NTP 1.25×10-5mmol,Bst DNA聚合酶8 U,F3/B3 5×10-6μmol,FIP/BIP 3×10-5μmol,62℃,45 min为最优反应条件;在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;对临床样品的阳性检出率与常规RT-PCR检测方法一致,但灵敏度高于PCR方法,最低检测限为10 pg,检测结果可直接通过肉眼观察来判断。该方法为番鸭呼肠孤病毒的可视化RT-LAMP快速检测试剂盒研制奠定了基础。     

我国甘薯E病毒全基因组序列特征及荧光定量检测技术的建立

【目的】甘薯E病毒(sweet potato virus E,SPVE)是甘薯上新发现的一种病毒。本研究对我国甘薯E病毒江苏徐州分离物(SPVE-XZ)的全基因组序列进行测定，分析该病毒基因组序列特征，并建立针对SPVE的荧光定量(quantitative PCR,qPCR)检测技术，为监测SPVE发生分布、检测种薯种苗中SPVE带毒情况并及时防控该病毒提供理论依据和技术支持。【方法】采用small RNA深度测序，结合RT-PCR和RACE技术，获得SPVE-XZ的全基因组序列，利用MegAlign、MEGA11等软件对获得的全基因组序列进行序列比对、系统发育关系分析。设计SPVE荧光定量检测引物，并通过对退火温度及引物浓度的优化，建立针对SPVE的qPCR检测方法，测定其特异性和灵敏度，应用于江苏省和山东省田间甘薯样品的检测。【结果】除ploy(A)外，所获得的SPVE-XZ全基因组序列全长为10 919 nt，包含1个长为10 560 nt的开放阅读框(open reading frame,ORF)，编码3 519 aa的多聚蛋白。5′非翻译区(5′untranslated re...