家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白提取方法的优化研究

分别用SDS法、煮沸法、碱溶法和Brosson法,提取家蚕微孢子虫孢壁蛋白,并对孢壁蛋白及处理后的孢子形态进行比较研究。结果表明,不同方法处理后的孢子形态均保持完整,SDS处理后孢子为短杆状且明显变得粗壮,煮沸处理后孢子变小呈梭形,其他方法处理的孢子均有膨胀现象。SDS-PAGE检测显示,SDS法提取的孢壁蛋白出现3条明显的主带,煮沸法提取的孢壁蛋白出现5条明显的主带,0.1 mol/L KOH提取的孢壁蛋白出现2条主带;而Brosson法提取的孢壁蛋白呈现出20~30条带,体现了家蚕微孢子虫孢壁蛋白组成的复杂性,并适合于孢壁蛋白质组学的研究。     

粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)培养细胞对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的吞噬过程观察

观察微孢子虫在非天然宿主细胞系的生物行为过程,有助于探究微孢子虫的侵染特异性机制。选用鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni,Tn)细胞系为材料,接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)孢子后观察其吞噬过程。结果发现:经氢氧化钾发芽预处理的Nb孢子虽然可以在Tn培养细胞液中发芽,但未见发芽孢子的孢原质进入Tn培养细胞;在接种Nb孢子浓度为2.0×105mL-1以上时,观察到孢子通过内吞作用进入了Tn培养细胞,但未见孢子的增殖;随着时间的延长和进入Tn培养细胞的Nb孢子的增加,可引起Tn培养细胞的超微结构变化,并导致细胞的裂解。以上结果说明,虽未见Nb以发芽形式感染Tn培养细胞,但Nb能够被吞噬进入Tn培养细胞并破坏其结构。     

柞蚕微孢子虫部分孢壁蛋白的分离鉴定及孢壁蛋白8的序列分析

研究柞蚕微孢子虫的孢壁蛋白组成和结构特点,有助于解明柞蚕微孢子虫在侵染过程中与蚕体细胞的互作机制。分别采用煮沸法和Laemmli法分离提取柞蚕微孢子虫总蛋白和孢壁蛋白,回收30kD左右的蛋白条带进行液质联用离子阱电喷雾质谱分析,获得的短肽序列经Mascot在线检索工具进行蛋白同源序列比对,共鉴定出27种具有功能注释的蛋白,有3种注释为孢壁蛋白。其中获得了与家蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NbSWP8)高度同源的柞蚕微孢子虫孢壁蛋白8(NaSWP8)的基因全长序列。序列分析表明NaSWP8与NbSWP8的氨基酸序列相似性达到90%,且均具有特征性的肝素结合基序,二者的编码基因核苷酸序列的非同义替换率和同义替换率比值(dN/dS)明显小于1,表明孢壁蛋白8基因在2种蚕类微孢子虫中受到纯化选择压力的作用,基因的功能相对稳定。     

家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25、SWP30、SWP32的表达谱分析

研究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的孢壁蛋白对于揭示家蚕微孢子虫感染宿主的分子机制具有重要意义。对已完成精细定位的家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25、SWP30、SWP32在家蚕中肠组织中的表达谱进行了分析。RT-PCR结果表明,SWP32在感染后24 h就可以检测到其转录本,SWP25、SWP30的转录本在感染后36 h可检测到,提示SWP32可能在孢子裂殖体阶段就需要发挥作用;3种孢壁蛋白在感染3 d后其转录本均达到较高水平,并在感染过程中持续保持,在感染后第10天仍能明显检出。3种孢壁蛋白在感染3 d后转录本量明显增加的现象与家蚕微孢子虫的生活史相符合,即:孢子母细胞在此阶段迅速增加并向成熟孢子转化,成熟孢子的孢壁在这一时期形成。3种孢壁蛋白的表达能在感染早期阶段的家蚕中肠组织中被检出,为进一步探讨3种蛋白的功能提供了线索,也为开发基于这3种蛋白的分子生物学及免疫学特异性的家蚕微粒子病早期诊断技术提供了理论依据。     

柞蚕微孢子虫3种孢壁蛋白的提取与鉴定

在微孢子虫侵染宿主的过程中,孢壁蛋白扮演着重要的角色。分别采用沸水浴法、SDS法从柞蚕微孢子虫(Nosema per-nyi,Np)孢子中提取孢壁蛋白以及利用发芽后的孢子壳提取孢壁蛋白,对提取的孢壁蛋白进行SDS-PAGE分析和质谱鉴定。结果显示,将发芽后的孢子壳以沸水浴法提取孢壁蛋白最为有效,但操作复杂,部分孢壁蛋白损失严重。初步鉴定从发芽后的孢子壳中提取的编号为P35、P32和P29的3种蛋白属于柞蚕微孢子虫孢壁蛋白,蛋白分子质量分别为35、32、29 kD,其中孢壁蛋白P32的含量最丰富,P35和P29的含量相对较低。根据相应肽指纹图谱预测孢壁蛋白P32的一级结构类似核孔蛋白,可能与孢壁的选择透过性有关,而P35与VASA2n蛋白的一级结构类似,因此有可能与柞蚕微孢子虫的繁殖有关。     

家蚕微孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定

用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)总蛋白为抗原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,第1次融合率为13.3%,第2次融合率为55.4%。建立间接酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体。初检阳性率分别为4.68%和5.26%。经3次亚克隆筛选获得了2株能稳定分泌抗家蚕微孢子虫的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G10和2B10。间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence test,IFAT)和Western-bloting分析证实所获得的单克隆抗体是特异针对家蚕微孢子虫蛋白的,将在孢子孢壁蛋白的研究中发挥重要作用。     

家蚕微孢子虫表面抗原蛋白对家蚕致病性的影响

家蚕微粒子病是由家蚕微孢子虫通过食下传染和胚种传染引起的,对蚕业生产影响很大,历来是蚕种的检疫对象,为此对家蚕微孢子虫的研究一直是一个重要课题。除Ｐａｓｔｅｕｒ(1870)提出的母蛾检验外,相继出现了双向免疫扩散法,凝集法,荧光抗体法,酶联免疫吸附法,酶标抗体法,免疫过氧化物酶染色法及单克隆抗体法等方法[1],这些方法各有特色。但基本上都是以识别检测微孢子虫的表面抗原蛋白为基础。河原勇[2]根据微孢子虫表面抗原蛋白的不同将家蚕Ｎｏｓｅｍａ属分为3种类型,即Ｂｏｍｂｙｃｉｓ型、Ｍ11型、Ｍ12型。本文以家蚕微孢子虫的表面抗…     

克孢灵对家蚕微孢子虫灭活作用的研究

用不同浓度克孢灵处理家蚕微孢子虫悬液后人工饲料接种、饲育和载体处理后桑叶接种、饲育,进一步考察了其对家蚕微孢子虫的灭活效果。结果显示15mg/L的浓度作用30min,或者25mg/L作用5min,对载体试验的游离微孢子虫可以达到完全灭活的目的。该研究结果,为大田生产、尤其蚕种生产部门利用该药防治微粒子病,并把该药正式开发为专门针对N.b孢子的桑叶消毒剂提供了可靠的依据。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)与其它微孢子虫及真菌的进化关系

综述了应用分子生物学和生物信息学对家蚕微孢子虫系统发育的研究进展,以及多菌灵等苯并咪唑类杀真菌剂对微孢子虫和真菌的抑制作用,认为研究家蚕微孢子虫和真菌的进化关系对家蚕微粒子病的控制技术研究具有重要参考价值。     

家蚕分离的微孢子虫Vairimorphasp.MG_4的研究

从家蚕分离到一种小型微孢子虫 (MG4 )。MG4 孢子大小为 2 72± 0 1 2 μm× 1 98±0 2 2 μm ;孢子具单核、双核 2种类型 ,极丝在 6～ 9圈之间 ;在家蚕体内以 2种不同的生活史发育 ,发育过程符合变态孢虫属Vairimorpha微孢子虫发育特征 ;对家蚕有弱的食下传染能力 ,主要寄生在后部中肠的气管丛 ;感染家蚕后未见胚种传染     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)交叉感染的孢子形态变化及表面蛋白差异

试验探讨了微孢子虫的交叉感染性与孢子表面蛋白的变化。结果表明,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)转主感染桑尺蠖(Hemerophila atrilineata)后孢子形态变为细长,分离纯化感染前和感染后的孢子表面蛋白,通过SDS-PAGE电泳发现形态变异株出现了34 kD和67 kD的差异带,在相同条带17、30、47、77和114 kD表达量存在明显的差异,但33 kD和43 kD条带表达量没有差异。孢子表面蛋白的差异性表达可能与微孢子虫感染适应性有关,而33 kD和43 kD可能是微孢子虫共有的保守蛋白。     

35℃高温对家蚕微孢子虫在BmN细胞中发育、增殖的抑制

研究了 35℃高温处理对家蚕微孢子虫体外发育、增殖的影响时期和时间。结果表明 :35℃高温对家蚕微孢子虫体外发育、增殖具有明显的抑制作用 ,其最为敏感的时期是微孢子虫的裂殖体增殖阶段 (接种后 2 4～ 72h) ,进入孢子形成期 (接种 72h以后 )抑制作用则明显降低。     

家蚕微孢子虫感染BmN细胞的差异表达基因筛选及Akirin的原核表达

为探究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染宿主细胞的分子机制,以感染Nb的家蚕卵巢上皮细胞(BmN)为材料,通过GeneFishing技术进行基因差异表达分析,发现感染Nb的BmN细胞有10个基因被诱导或抑制表达,这些差异表达基因功能涉及蛋白质合成、细胞信号转导、线粒体呼吸链电子传递、细胞能量代谢、细胞免疫及一些未知功能。运用RT-PCR方法克隆在感染Nb的BmN细胞中差异表达的免疫相关基因Akirin,获得一个长588 bp的完整ORF,编码195个氨基酸,预测蛋白质分子质量21.98 kD,等电点为8.97,属于碱性蛋白,该蛋白质经SignalP在线预测未见信号肽。通过原核表达获得家蚕Akirin的外源融合表达蛋白,为进一步研究家蚕Akirin在家蚕先天免疫系统中的功能奠定了基础。     

家蚕微孢子虫全基因组分析支持微孢子虫与真菌的亲缘关系

微孢子虫(microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,虽然分子生物学的研究证据表明其与真菌(fun-gi)存在亲缘关系,但这些证据均是基于单个或少数几个基因构建系统进化树而得出的。利用家蚕微孢子虫全基因组数据,采用基于基因同源性的Darkhorse基因组统计方法,鉴定家蚕微孢子虫基因组中每个基因的来源谱系,并通过全基因组谱系可能性指数(lineage probability index,LPI)分析微孢子虫与其他物种的亲缘关系。结果表明家蚕微孢子虫与其他微孢子虫的LPI加权平均值为0.93,具有最近的亲缘关系,与真菌界的LPI加权平均值为0.65,与原生生物界的LPI加权平均值为0.38。由此证明微孢子虫与真菌存在着更近的亲缘关系,微孢子虫门属于真菌界而非原生生物界。