地高辛标记探针检测重组鸡痘病毒中的MDVgB基因

以XbaI从pVLgB中切下gB基因片段，用dig试剂盒通过六聚核苷酸随机引物合成DNA探针，对粗提的重组FPV、MDVGA、FPV282E4和CEFDNA以及pFGB1175质粒DNA进行打点杂交（Dot－blot）。经免疫学测定、NBT显色后发现，重组FPV、MDVGA、pFGB1175斑点呈明显阳性反应；而FPV282E4和CEFDNA则呈阴性反应．从而在DNA水平上证实了重组FPV基因组中gB基因的存在。     

鸡痘病毒基因探针检测方法的建立及初步应用

利用PCR方法成功克隆了鸡痘病毒（Fowl poxvirus，FPV）4b核心蛋白基因549bp片段，序列分析表明，该序列与模板DNA（AF198100）碱基序列的同源性为99．45％，只有3个碱基差异，第215位由C→T，第386位由T→A，第388位由G→A。回收FPV4b核心蛋白基因549bp片段，以其为模板制备了地高辛标记的DNA探针。对新标记的探针进行标记效率检测，结果显示其标记效率为100mg／L；敏感性检测表明，该探针对同源DNA的检出限量为10Pg；特异性检测结果表明，用本试验所标记的探针对提取的FPV282E4和FPV儿株DNA、重组质粒pMD 18-T-4b进行检测结果均呈阳性，而鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、CEF的核酸提取物均成阴性，说明该探针具有较强的特异性。初步应用表明，本试验所建立的FPV的基因探针检测法可用于FPV的检测。     

禽痘病毒的分子生物学Ⅱ禽痘病毒载体（续）

禽痘病毒的分子生物学Ⅱ禽痘病毒载体（续）王志亮综述刘秀梵审校（扬州大学农学院动物医学系）２．３外源基因痘病毒转录的特点决定了外源基因必须符合以下原则：２．３．１外源基因应是无自身启动子的单纯编码阅读框，因为痘病毒只能识别自家的启动子。２．３．２外源...     

禽痘病毒载体及其应用

禽痘病毒(fowlpox virus,FPV)载体在近几年受到越来越多学者的关注。禽痘病毒载体的原理,是把外源基因插入到病毒的适当位置,通过同源重组把外源基因重组到病毒基因组的复制非必需区域。外源基因通过修饰等过程可以得到高效的表达,表达产物生物活性及相关功能没有改变,刺激机体产生较强的免疫应答。禽痘病毒被用作表达载体后,相继成功地表达了来源于禽类病毒、动物病毒,乃至能感染人类病原体的保护性抗原基因,现已被广泛用作基因工程的重要工具。作者就禽痘病毒粒子的结构、生物学、分子生物学、禽痘病毒载体及其应用等几个方面进行了阐述。     

鸡痘病毒PCR检测方法的建立

根据已发表的鸡痘病毒 (fowlpox virus,FPV) 4 b核心蛋白基因的核苷酸序列设计合成了 2对引物 ,通过对影响PCR扩增因素的优化 ,2对引物在同一反应条件下 ,以抽提 FPV DNA或直接用其毒液制备的模板均能分别扩增出预期的 5 4 9、136 1bp的片段。特异性检测表明 ,2对引物对 FPV10 2株、FPV2 82 E4 (北京 )、FPV2 82 E4 (吉林 )、v FV2 82重组鸡痘疫苗毒及 FPV临床分离株均能扩增出相应特异性片段 ,而用鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、羊痘病毒、鸡胚成纤维细胞 (CEF)制备的模板分别进行 PCR扩增却成阴性。敏感性检测表明 ,2对引物 (p1 ,2 、g1 ,2 )分别能检测到 10 - 2 、10 - 3fmol的 FPV DNA和 10 0 .5、10 - 0 .5TCID50 的病毒。以上结果表明 ,本试验所建立的 FPV PCR检测法具有较高的特异性和敏感性 ,模板制作简单 ,完全可用于 FPV的检测     

禽痘病毒的分子生物学——Ⅱ禽痘病毒载体（续）

历史上，痘菌病毒（VacciniaVirus）的应用曾帮助人类消灭了灾难性的疾病一天花，时至八十年代初，当Moss和Paoletti的实验室各自独立地证实痘苗病毒基因组的标记拯救现象时，这一准备冬眠的病毒又呈现了新的活力，它被广泛用作外源基因的表达载体。十多年来，50余种原核、真核基因在其中获得表达，而且所构建的活载体疫苗一般都具有良好的免疫原性。然而，由于痘苗病毒在使用过程中能引起严重的副反应，以此为基础的重组疫苗并未能获准在实际中反应。八十年代后期，在兽医领域内开始开发宿主持异性的症病毒载体，禽痘病毒载体即应运而生…     

禽痘病毒活疫苗中网状内皮组织增生病病毒的分离鉴定及其序列比较

为了从怀疑污染禽网状内皮组织增生病病毒（Reficuloendotheliosisvirus,REV）的禽痘病毒（Fcwlpoxvirus,FPV）活疫苗中分离病毒,将市场上购买的某些厂家的禽痘弱毒疫苗接种7日龄SPF雏鸡。在5d后采其抗凝血浆接种鸡胚成纤维细胞（chickenembryofibroblast,CEF）,在连续传2代后,用REV特异性单抗做间接免疫荧光试验,确认REV感染,命名为JS0809。提取感染细胞的DNA,采用PCR扩增env基因。测序分析表明,该毒株的env基因开放阅读框同大部分REV-毒株一致,为176lbp。JS0809的囊膜蛋白基因（envelopeproteingene,env）与国内已发表株的同源性高达96．0％-99．％。相对而言,它与早年分离到的毒株的同源性只有96％-97．3％,但与近几年的分离珠的同源性则均高达99．5％-99．8％。它与整合进FPV野毒株中的全基因组REV的env基因同源性很高为99．8％,而与整合进FPV疫苗株中全基因组REV的env基因同源性较低仅为97．3％。本研究证实了在我国生产的某些FPV疫苗中存在REV污染,所污染的REV的env基因更接近最近的流行野毒,这是国内第一次报道从禽痘弱毒疫苗中分离~qREV活毒。     

火鸡出血性肠炎病毒分子生物学研究进展

本文阐述了火同血性肠炎病毒近年来在分子生物学方面的研究进展。HEV基因组全长26263bp，是目前所知道最短的禽腺病毒。基因组中G＋C含量为34.93%。与其它腺病毒相似，含有39bp的末端重复序列，晚期蛋白基因（52k,Ⅲa，五邻体，核心蛋白，六邻体，肽链内切酶，100k,P^Ⅷ，和纤维蛋白），早期基因（聚合病毒，末端蛋白，DNA结合蛋白）和中期基因VIa2及其编码蛋白与其它腺病毒相比具有相似性，基因组中无明显的E1、E4区。然而，作为腺病毒分类的三个标准即基因组长度、末端重复序列及G＋C含量，其与牛腺病毒在分类地位上最接近，开放阅读框架与已发表的禽腺病毒无相似性。     

我国鸡痘病毒野毒重组株的流行初探

从山东、河南等省不同的鸡痘发病地区分离和鉴定了20株鸡痘病毒野毒株,并分别根据禽网状内皮组织增生症病毒（REV）和鸡痘病毒（FPV）的基因组设计合成了1对上游源自REV基因组和下游源自FPV基因组的引物。随机从20株FPV野毒株中挑选7株接种鸡胚成纤维细胞,提取细胞DNA作为模板,利用这对引物进行PCR反应,结果均扩增到了779bp大小的目的片段。将其中1个片段测序发现此片段为REV和FPV的整合序列,其中REV序列426个碱基,FPV序列为304个碱基。结果表明,我国FPV野毒中已整合入REV的基因序列,而且这种整合株所占比例相当高,已成为主要的流行毒株。     

猪细小病毒分子生物学研究进展

１PPV的基因组结构和复制型DNA的特点PPV为细小病毒科细小病毒属的成员，是一种自主复制性细小病毒（autonom－ouslyreplicatingparvovirus），其基因组为单链线壮DNA分子，大小约５０００个核苷酸（nt），成熟的病毒粒子仅含有负链DNA基因组。基因组两端均有发夹结构，３’－端的１０２nt的回文序列中断，折叠形成Y型结构；５’端有一个１２７nt的回文序列，中间被一个２４nt的短回文序列中断，折叠形成U型结构。PPV基因组的这种末端结构对其复制是非常重要的。PPVDNA完全依赖于宿主DNA的复制机制进行自身复制，并且几乎只能在…     

整合禽网状内皮组织增殖病病毒基因的鸡痘病毒野毒株致病性研究

以分离保存的整合禽网状内皮组织增殖病病毒（REV）基因的鸡痘病毒（FPV）野毒株接种CEF细胞,间接免疫荧光试验检测REV,结果未检测到游离REV病毒粒子;以该毒株人工感染7日龄SPF雏鸡,同时设阴性对照,常规免疫新城瘦弱毒苗（ND）。接毒后每周采血动态检测NDV抗体、REV抗体、REV病毒血症;同时对试验鸡免疫器官指数、组织学变化动态观察,并对免疫器官的细胞凋亡动态检测。结果表明,整合REV基因的FPV感染后2周可引起鸡REV病毒血症,并产生REV抗体;导致中枢免疫器官发育分化不良,尤其对胸腺的影响最为明显,攻毒2周后,试验组与对照组相比,胸腺指数明显下降（P〈o．05）;免疫器官主要表现实质细胞数量少,正常结构发育不良,间质结缔组织增生而发生纤维化;细胞凋亡检测证实免疫器官的淋巴细胞和巨噬细胞均有明显的凋亡现象,细胞凋亡是引起免疫器官萎缩的主要原因。对新城疫疫苗免疫反应呈显著的抑制作用,攻毒3周后,试验组血清新城疫病毒抗体滴度显著低于对照组（P〈0．05）,其抗体滴度峰值低,维持时间短,下降速度快。本试验证实FPV整合REV前病毒基因组会明显改变FPV的致病性,表现某些REV的致病特征,使感染鸡REV抗体转为阳性并出现病毒血症,进一步证实REV可以通过基因组整合于FPV而进行传播的推测。     

国外禽痘病毒疫苗自然重组株整合序列的研究

本文根据禽痘病毒（FPV）基因组中禽网状内皮组织增生症病毒（REV）常见整合区域的序列设计合成一对引物，对国外一株FPV疫苗进行了PCR扩增，结果扩增出一条1478bp的片段，经过测序和序列分析表明该片段为REV和FPV的整合序列，FPV序列中整合了大小为193bp的REV长末端重复序列，进一步比较显示该序列与国外REV毒株APC566、713和SNV的同源性分别为：99．6％、98.0％和87．3％，与我国REV分离株HA9901的同源性只有83．6％。同时该REV整合序列与国外已经测定的FPV毒株AJ581527、AY255633、AF198100、AF006064和AF246698比较时发现，这些毒株中含有的REV序列不仅完全一致，而且REV序列的插入位点也完全相同。这说明国外FPV疫苗中不仅含有REV整合序列，而且已经存在多年了。     

禽痘病毒分子生物学特性及在哺乳动物中的应用

禽痘病毒(Avipoxvirus)是痘病毒科的成员,可以作为病毒载体表达外源基因。近年来禽痘病毒作为非复制型载体的应用已成为国内外研究的热点,成功地构建了表达不同外源基因的重组禽痘病毒,在肿瘤疾病和艾滋病的预防和治疗中都有不俗的表现。文章主要对禽痘病毒的分子生物学特性及其在哺乳动物中的应用作了概述。     

鸡痘病毒弱毒疫苗株在鸡组织内的分布、消长规律及毒性试验

通过两侧翅内侧皮肤无血管处刺种和滴鼻、点眼等途径给10日龄商品蛋公鸡接种鸡痘病毒（FPV）弱毒疫苗株，利用PCR的方法检测其在鸡体内的分布与消长规律并对其毒性进行了研究。刺种组：接种后6h在刺种部位皮肤即可检测到病毒DNA；接种后1d，皮肤、肺、脑PCR检测阳性；7d，在皮肤、肺、脑，心、脾、肾、法氏囊均可检测到病毒DNA，肝为疑似；10、15d，肝为阳性；21d，脾、法氏囊PCR检测为阴性，肝为疑似；28d，除刺种部位皮肤外所有内脏器官中均未检测到病毒DNA，但刺种部位皮肤一直到接种后35d仍可检测到病毒DNA。而对照组在整个试验期间PCR检测均为阴性。滴鼻点眼组：基本规律与刺种组相同。接种后3h，在肺部即可检测到病毒DNA；6h，在肺和脑部PCR检测成阳性，法氏囊为疑似；1d，在肺、脑、心、脾、肾、法氏囊均可检测到病毒DNA，肝为疑似；21d，肺、肾、法氏囊、脑均为阳性。其中脑一直持续到接种后28d。而对照组在整个试验期间PCR检测均为阴性。毒性试验表明，FPV弱毒疫苗株虽使用安全但通过翅内侧皮肤无血管处大量刺种存在导致全身皮肤感染出痘的危险。     

马立克氏病病毒gB基因的克隆及理组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒（MDV）2.8kbgB基因，并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ位点。然后用PstⅠ/NotⅠ酶切回收gB片段，插入到转移载体pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ/NotⅠ酶切位点处，构建了转移质粒pEFgpt12s-gB。将该质粒与鸡痘病毒（FPV）野毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），通过MXHAT选择培养基进行筛选，蚀斑纯化，经PCR扩增证实重组病毒中含有gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别，病毒效价分别为10^-5.43TCDID50/mL和10^-6TCID50/mL，表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性。     

鸡痘病毒FJ01株的分离鉴定

为调查福建规模化养鸡场病鸡的死亡原因,试验以福建省送检的鸡冠及头部皮肤有大量结节状痘痂的病鸡病料为研究对象进行了PCR鉴定。初步鉴定为鸡痘病毒（FWPV）株后,通过接种鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）分离病毒;用原代鸡胚成纤维细胞（CEF）和传代细胞DF-1细胞对病毒进行传代,观察该分离毒株在两种细胞上培养特性的异同;对被感染的CEF进行超薄切片观察病毒的分布及病毒粒子的形态;并针对该分离株的TK基因和FPV175基因序列进行同源性分析。结果显示,接种经抗生素处理后的病料匀浆液上清的CAM出现大面积单个白色隆起的痘斑,匀浆痘斑后同时接种CEF和DF-1细胞,两种细胞均能产生稳定可持续传代的细胞病变,但病变出现的时间及病变程度不同;透射电镜下观察到典型的FWPV粒子密集分布在CEF的胞浆中,清晰可见卵圆形外膜包裹着的两侧凹陷的核心。对其中23个病毒粒子进行统计测得病毒粒子的大小为（258~344） nm×（153~238） nm;针对FWPV TK基因和FPV175基因的PCR检测及测序结果与GenBank收录的FWPV（登录号：NC_002188.1）核苷酸序列同源性分别高达100%和99.8%。以上结果表明该分离毒株为FWPV,命名为FWPV-FJ01,为国内FWPV的防治提供了参考依据。     

马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

将马立克氏病病毒gB基因用EcoR I从质粒pUR-MDVEgB中切下。两端补平后，插入到质粒pEFgpt12s的Pst I酶切位点。构建了含有完整的MDVgB基因的转移载体pEFgpt12s-gB。这个载体的特点是，它含有两个启动子，在强的复合启动子Spromoter的下游是插入的gB基因，另一个反向启动子vvP7.5的下游 是标记基因Ecogpt，它的两端是FPV的非必需区。携带gB基因的质粒pEFgpt12s-gB通过磷酸钙的方法转染用282e4株FPV感染3-4h的鸡胚成纤维细胞。通过药物筛选 ，得到含有gB基因的重组病毒。通过PCR、免疫荧光检测，证实了重组病毒中含有gB基因，并且gB糖蛋白也得到了表达。     

利用BrdU在CEF（TK^＋）细胞中筛选TK^—重组鸡痘病毒

将新城疫病毒（NDV）四平株HN基因，插入不含报告基因，以TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体pUTA-2中的复合启动子下游，获得重组表达质粒pUTA-2HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒（FPV）感染的鸡胚成纤维细胞（CEF），培养、收获病毒后，用含40mg/L5－溴－2－脱氧尿嘧啶（BrdU)的培养液，在CEF（TK^ )细胞中筛选培养2代，然后用不含BrdU的培养液进行病毒蚀斑纯,化成功筛选出表达NDV HN蛋白的TK^-重组鸡痘病毒。     

重组鸡痘病毒载体及其在禽流感疫苗中的应用

禽流感(Avian Influenza,AI)是严重威胁养禽业的烈性、病毒性传染病。禽流感病毒变异快,亚型多,仅其表面抗原血凝素(HA)的变异即会导致病毒得以逃避宿主免疫系统的监视,从而使针对该病的疫苗研究举步维艰。随着DNA重组技术的发展和应用,禽流感疫苗研究已逐步从常规疫苗向基因工程疫苗过渡。鸡痘病毒(fowlpoxvirus,FPV)载体能够高效表达外源基因,已成功应用于多种禽病源基因的表达,如马立克病毒gB及pp38基因,禽流感病毒HA和NP基因,传染性法氏囊病毒A片段的vp243或vp2基因,新城疫病毒HN及F基因等,并在接种后显示了良好的免疫原性。F…     

表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒的部分生物学特性研究

为了评价转基因对鸡痘病毒(FPV)生物学特性的影响,通过电镜观察表达新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)基因重组鸡痘病毒(rFPV-12LSHN)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF).结果表明:在FPV中插入NDV HN基因后,不改变rFPV的形态、病毒成熟过程;rFPV-12LSHN与FPV在CEF上的产量无...