利用GS基因构建茶氨酸生物合成工程菌的研究

为了高效合成茶氨酸,本研究通过将荧光假单胞菌GS基因转接入pET32a质粒中,再将重组质粒转化到E.coli BL21中,构建了一种生物合成茶氨酸的基因工程菌。工程菌株经0.1mmol/LIPTG,28℃诱导表达,湿菌体的酶活达到41.79U/mg prot,大约是出发菌株E.coli BL21的126.64倍。工程菌催化L-谷氨酸钠和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的产量达到6.2g/L,其催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺反应生成茶氨酸的能力较出发菌株E.coliBL21有显著提高。     

茶氨酸酶促生物合成研究进展

茶氨酸系茶树（Camellia sinensis）特征性成分,具有放松镇静、增强记忆、保护神经、化疗调节等诸多生理活性。目前发现能催化茶氨酸生物合成的酶有7种,它们分别是茶氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、γ-谷氨酰甲胺合成酶、谷氨酸合成酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷氨酰胺酶和γ-谷氨酰转肽酶。茶氨酸生物合成反应有两种代表类型：（1）谷氨酸和乙胺为底物的连接合成反应（需ATP供能）;（2）谷氨酰胺和乙胺为底物的酰基转移反应。本文对茶氨酸酶促合成途径进行了综述,以此为茶氨酸微生物合成技术的开发应用提供参考依据。     

大规模悬浮培养茶叶细胞合成茶氨酸培养基组成优化研究

婺源绿茶嫩叶用MS培养基（加IBA 2βmg/L,6-BA 4βmg/L,盐酸乙胺25βmmol/L）进行茶叶愈伤组织悬浮培养,采用正交试验设计研究了培养基不同组成条件对茶叶细胞大规模悬浮培养过程中细胞生长与茶氨酸合成的影响。结果显示,整个培养周期中,细胞收获量和茶氨酸积累量峰值出现时间为培养的第19~22βd;在NH₄⁺/NO₃^- 1.0/60.0βmmol/L、K⁺ 100.0βmmol/L、Mg²⁺ 3.0βmmol/L、H₂PO₄^- 3.0βmmol/L、蔗糖30.0βg/L、水解酪蛋白2.0βg/L条件下,茶叶细胞生长量和茶氨酸积累量分别可达到16.33βg/100βml培养液和3.357βg/100βml培养液;提高培养基中水解酪蛋白浓度可使细胞对数生长期和稳定期得到延长,并有利于茶氨酸积累;H₂PO₄^-浓度主要影响细胞生长速率和茶氨酸积累速率的同步性,低H₂PO₄^-浓度环境中茶氨酸积累速率峰值滞后于细胞增长速率峰值,高H₂PO₄^-浓度环境中早于细胞生长速率峰值出现时间;K⁺ 和蔗糖对细胞生长的影响均不明显;Mg²⁺对细胞生长产生明显的影响;NH₄⁺/NO₃^-对茶氨酸合成具有非常显著的影响。从生产效率考虑,培养周期以19~22βd为宜。     

配体交换色谱手性流动相法拆分和定量茶氨酸对映体

建立了配体交换色谱手性流动相法拆分茶氨酸对映体的方法。采用Polaris C₁₈柱;流动相为L-脯氨酸：Cu²⁺（摩尔比）为2:1,Cu²⁺浓度为0.5βmmol/L,pH6.8,甲醇的加入体积比为2%;波长254βnm;流速0.9βml/min;柱温30℃。L-茶氨酸的进样量在0.09542βμg~4.241βμg范围内峰面积与进样量之间线性关系良好,回收率在97.45%~100.4%之间;D-茶氨酸的进样量在0.08486βμg~4.243βμg范围峰面积与进样量之间线性关系良好,回收率在97.07%~100.1%之间。该方法通用,准确。     

茶树发根中茶氨酸和儿茶素类含量的分析

茶树发根在LG₀培养基和添加1βmg/L IBA的1/2MS培养基上生长迅速,但只在一个培养于LG₀培养基的发根克隆中检测到高含量的茶氨酸,含量达到23.12βmg/g鲜重,高于未转化根的18.77βmg/g鲜重。除茶氨酸外,该发根克隆中也检测到高含量的天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和精氨酸。发根克隆培养于添加1βmg/L IBA的1/2MS培养基,茶氨酸的含量则显著降低,说明培养基组成也是影响发根中茶氨酸的含量的因素之一。茶树发根中也含有少量的儿茶素类单体,主要为儿茶素和表儿茶素。     

酶法拆分DL-茶氨酸及其分离纯化

将DL-茶氨酸乙酰化为N-乙酰-DL-茶氨酸,利用本实验室筛选的有较高氨基酰化酶活性的真菌刺孢小克银汉霉9980（Cunnighamella echinulata 9980）对DL-茶氨酸进行拆分并对拆分条件进行摸索。结果表明：反应最适温度50℃,最适pH7.0,底物浓度0.5mol/L,湿菌体量4g/100βml,拆分时间30h,拆分率可达92％。产物经JK008阳离子交换树脂氨性柱分离,L-茶氨酸收率84.3％,[α] =8.1(c=2,H₂O), 符合JP2000药典。     

四川黑茶品质化学成分的研究

采用氨基酸自动分析法、高效液相色谱法分析了四川黑茶原料、渥堆叶、康砖成品茶的氨基酸、儿茶素组成含量及咖啡碱、茶多酚、水浸出物的含量。四川黑茶原料氨基酸含量为1424.00βmg/100g,必需氨基酸含量为547.00βmg/100g,茶氨酸含量为87.15βmg/100g,儿茶素含量为27.63βmg/g,咖啡碱、茶多酚、水浸出物含量分别为1.30%、8.18%、26.94%;渥堆叶氨基酸含量为1590.00βmg/100g,必需氨基酸含量为668.00βmg/100g,茶氨酸含量为67.62βmg/100g,儿茶素含量为27.52βmg/g,咖啡碱、茶多酚、水浸出物含量分别为1.24%、7.90%、24.53%;康砖成品茶氨基酸含量为1420.00βmg/100g,必需氨基酸含量为529.00βmg/100g,茶氨酸含量为66.88βmg/100g,儿茶素含量为13.65βmg/g,咖啡碱、茶多酚、水浸出物含量分别为1.27%、5.99%、23.92%。     

茶尺蠖幼虫取食提高茶树儿茶素代谢响应强度

研究了茶尺蠖幼虫为害茶树叶片对儿茶素合成途径的影响。采用3龄茶尺蠖幼虫取食茶树新梢芽下第二叶,测定了儿茶素合成相关基因的表达水平和儿茶素含量。研究结果表明,与对照相比,茶尺蠖幼虫为害后3、6、12βh显著诱导了CsANR基因的相对表达水平,且在为害后3βh和12βh达到了极显著差异。CsLAR基因在茶尺蠖为害后6βh和12βh,与对照具有显著差异。茶尺蠖幼虫为害后24βh显著诱导了没食子酸、没食子儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯含量的升高,而茶尺蠖为害后48βh仅没食子酸和没食子儿茶素的含量显著高于对照;儿茶素、表没食子儿茶素和没食子儿茶素没食子酸酯在茶尺蠖为害后24βh和48βh均没有被显著诱导。上述结果表明茶尺蠖幼虫为害提高了茶树儿茶素合成途径的代谢强度和儿茶素类化合物的积累。     

LED黄光对工夫红茶萎凋过程香气相关酶基因表达及活性影响

将政和大白茶鲜叶置于LED黄光下照射萎凋16βh,以室内萎凋为对照,按工夫红茶工艺制成毛茶。对萎凋过程中萎凋叶的β-葡萄糖苷酶基因（CsBG1、CsBG2）、β-樱草糖苷酶基因（CsBP）的相对表达量、β-葡萄糖苷酶的活性,及毛茶挥发性香气组分进行分析,结合感官审评,研究黄光萎凋对工夫红茶品质的影响。结果表明,在LED黄光萎凋下,CsBG1、CsBG2表达量明显提高,萎凋第6βh CsBG2相对表达量最高,显著高于对照组;CsBP在黄光萎凋全过程呈上调表达。LED黄光前期促进萎凋叶香气相关酶基因上调表达,在萎凋后期调控β-葡萄糖苷酶活性提高,最终使得工夫红茶甜花香显现,品质提升。     

枯草芽孢菌株TL2对茶轮斑病的防病机制

枯草芽孢菌株（Bacillus subtilis）TL2能产生多种外分泌抗菌蛋白,抑制茶轮斑病菌（Pestallozzia theae）的菌丝生长及其分生孢子的形成和萌发。另外,菌株TL2通过改变茶树体内活性氧代谢相关酶系如SOD等的活性,以调节茶树受轮斑病菌侵染后活性氧的代谢平衡,同时诱导茶树产生抗性酶系如PAL和β-1,3-葡聚糖酶,以限制茶树轮斑病菌的扩展。     

基因工程菌生物合成茶氨酸条件研究

研究了不同诱导条件对基因工程菌催化合成茶氨酸的影响,确定了较为优化的诱导表达条件;通过单因子试验研究了不同反应条件对基因工程菌催化合成茶氨酸的影响,研究结果表明反应体系中较高的菌体浓度对催化茶氨酸有一定的抑制作用;高L-Gln浓度可以提高茶氨酸的生成量,但是却降低了L-Gln的转化率;基因工程菌催化合成茶氨酸的最适pH是9.5左右,较为适合的反应温度是32℃~37℃。     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX具有抑菌、抗褐变和保鲜功能。以短短芽胞杆菌菌株FJAT-0809-GLX总DNA为模板,采用PCR扩增超氧化物歧化酶(Supseroxide dismutase,SOD)基因,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行序列测定,结果显示SOD基因序列长度为609 bp(Gen Bank登录号:KM255665),编码202个氨基酸残基。将SOD基因片段与同样酶切的表达载体p ET-28a连接,构建重组表达载体p ET-28a-SOD,转入大肠杆菌BL-21,采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在菌体中存在约25 ku的蛋白表达产物,与该基因ORF预期大小接近。以上结果为进一步研究该酶的生理生化特性奠定了基础。     

茶氨酸生物合成基因工程菌的质粒稳定性研究

研究了茶氨酸生物合成基因工程菌重组质粒pET32a-GGT的稳定性。结果表明,该基因工程菌在连续传代100代后,质粒的目的基因片断没有缺失,具有结构稳定性;但在无抗生素选择压力下,连续传代20代后开始出现质粒丢失的细胞,连续传代100代后18%的细胞含有正常质粒,因此,表现出一定的分裂不稳定性。该基因工程菌在优化培养基和优化条件下的整个发酵过程中,始终表现出良好的结构和分裂稳定性,γ-谷氨酰转肽酶的活性为4.64U/ml,催化合成茶氨酸的产量为35.18g/L。     

小麦高分子量谷蛋白亚基1Dx5基因在大肠杆菌中的表达

为了给小麦优质亚基研究奠定基础,将高分子量谷蛋白亚基1Dx5基因的核苷酸序列与载体pRSET A重组,将构建好的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株,通过IPTG使其得到了成功表达.大肠杆菌中表达的1Dx5亚基在SDS-PAGE上与小麦品种钱尼中的1Dx5亚基具有相似的迁移率.用Western blot技术成功检测到了目的基因产物.通过改变IPTG浓度、诱导时间、培养基成分及初始菌液浓度研究了最适表达条件.结果表明,最适表达条件为:LB培养基,菌液初始浓度(OD600)0.4～0.6,IPTG浓度0.4mmol/L,诱导时间为3～5 h.     

香蕉ACC合成酶含3''''末端的cDNA克隆

采用 ３＇ＲＡＣＥ方法对香蕉（Ｍｕｓａ ＡＡＡ Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ Ｓｕｂｇｒｏｕｐ）ＡＣＣ合成酸含 ３＇末端的 ｃＤＮＡ进行扩增，扩增产物被克隆到ｐＣＲ■２．１载体上，转化大肠杆菌ＤＨ５ α，筛选到重组质粒（ｐＡＣＳ２），并对插入片段进行序列测定。结果表明，３＇ＲＡＣＥ产物长 １６８０ ｂｐ，其中一个 开放读框内的核苷酸序列编码４４４个氨基酸，氨基酸序列包括了ＡＣＣ合成酶中所应具有的７个高度保守区。同时该产物还有长２６９ ｂｐ的３＇末端，并具有完整的 Ｐｏｌｙ（Ａ）尾（２４ｍｅｒ）。     

香蕉ACC合成酶含3＇末端的cDNA克隆

采用3'RACE方法对香蕉(Musa AAA Cavendish Subgroup)ACC合成酶含3'末端的cDNA进行扩增,扩增产物被克隆到pCR*2.1载体上,转化大肠杆菌DH5α,筛选到重组质粒(pACS2),并对插入片段进行序列测定。结果表明,3'RACE产物长1 680 bp,其中一个开放读框内的核苷酸序列编码444个氨基酸,氨基酸序列包括了ACC合成酶中所应具有的7个高度保守区。同时该产物还有长269 bp的3'末端,并具有完整的Poly(A)尾(24mer)。     

新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ的原核表达、蛋白纯化及其活性鉴定

 通过PCR方法从pCAMBIA1305载体上克隆了新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ的全编码序列,并插入到原核表达载体pET30a（+）中,构建了重组质粒pET30a nptⅡ。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌,经IPTG诱导,获得了相对分子量为35 kD的表达蛋白,约占全菌总蛋白的45％。表达蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。用5 mmol/L 二硫苏糖醇和1％十二烷基肌氨酸钠变性溶解包涵体,经透析后复性获得了可溶性重组蛋白。将可溶的表达蛋白用Ni2+ NTA亲和层析纯化,获得纯化的NPTⅡ蛋白,电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度达95％以上。体外活性检测显示,NPTⅡ蛋白具有良好的生物活性,在浓度30 μg/mL以上时可使卡拉霉素失去抑菌活性。     

Rapid detection of Salmonella dublin by PCR amplification of the SopE gene and its cloning

This study is directed towards the method of amplifying and cloning the SopE gene, that encodes Salmonella outer protein E. Strains used in this study were S. dublin collected from Kermanshah province. Genomic DNA was extracted by the general boiling method. Using the specific primers, a part of SopE gene was multiplied. The PCR product was inserted into the cloning vector (pTZ57R/T). Furthermore, E. coli DH5alpha bacteria were transformed to amplify the recombinant plasmid. Recombinant clones were identified by blue/white selection. Recombinant plasmids were purified by alkaline lysis procedure. Moreover, identity of the SopE/pTZ57R/T product was confirmed by restriction enzyme digestion assay and sequencing. Finally, the cloned gene was compared with that published by the NCBI Genbank (L78932). The results showed that the obtained sequence differed in four nucleotides which resulted in two amino acid differences. The cloned SopE was submitted to the NCBI Genbank (EU399750).     

茶树Bt和Cpti双价抗虫基因转化研究（简报）

利用转基因获得抗虫茶树品种是防治茶树害虫的重要途径。将含有Bt和Cpti双价抗虫基因的质粒转入感受态E.coitl DH5α菌株并进行培养、提取和扩增后的质粒,注入茶树花期的子房内,种植接种后的茶籽,并对获得的植株进行检测。