家蚕眠期血淋巴酚氧化酶活性变化及其基因表达分析

[目的]探究酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)及酚氧化酶在家蚕眠期血淋巴中的变化规律,为深入解析家蚕眠期酚氧化酶的功能及其基因表达特征提供新线索.[方法]以家蚕四龄将眠、四龄眠(头壳刚开裂)0h、四龄眠6 h、四龄眠12 h、四龄眠24 h和五龄起蚕为试验材料,采用实时荧光定量PCR检测其血淋巴PPO1和PPO2基因的表达情况,并分析血淋巴酚氧化酶活性的变化规律.[结果]家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因在四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期均有一定程度的表达,且两者的变化规律一致,表现为四龄将眠最高、五龄起蚕最低,总体上呈先减后增再减的变化趋势.在家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性整体上也呈先降低后急剧升高再降低的变化趋势,四龄将眠为5.99 U/mg,五龄起蚕为6.02 U/mg,与酚氧化酶原基因表达模式基本一致.[结论]家蚕四龄将眠至五龄起蚕不同发育时期血淋巴酚氧化酶活性变化规律与酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的转录表达模式基本一致,说明酚氧化酶在家蚕眠期即发挥免疫防御功能,又参与蚕体新旧表皮的更替过程.     

饥饿对家蚕DefensinA和DefensinB表达水平的影响

通过不同时间饥饿处理5龄3 d家蚕,采用实时荧光定量PCR检测脂肪体DefensinA和DefensinB表达情况。结果显示,家蚕饥饿处理8,16,24 h后,DefensinB表达量均呈现上调趋势,其中饥饿16 h时DefensinB表达量上调最为明显,而DefensinA几乎无上调表达趋势。结果说明饥饿胁迫能诱导抗菌肽基因DefensinB的表达。     

BmNPV对家蚕不同组织ALP活性及其基因表达的影响

【目的】探究家蚕感染BmNPV后,不同组织碱性磷酸酶(ALP)及其基因表达变化规律,为阐明BmNPV的侵染机制及培育抗NPV蚕品种的选育提供借鉴和思考。【方法】通过经口添食BmNPV,检测分析家蚕中肠、血淋巴和脂肪体ALP基因的表达水平及其编码的碱性磷酸酶活性变化情况。【结果】家蚕中肠ALP基因在感染BmNPV后6、9和12 h呈现上调表达趋势,其编码的碱性磷酸酶活性显著高于对照组,在感染24 h基因表达被抑制,同时酶活性显著降低。血淋巴碱性磷酸酶及ALP基因对BmNPV的响应略晚于中肠,ALP基因在感染9 h开始上调表达,在12 h表达量最高,在24 h表达量急剧降低。碱性磷酸酶活性在9和12 h极显著高于对照组,而在24 h急剧减弱,显著低于对照组。脂肪体ALP基因表达量及碱性磷酸酶活性仅在感染12 h显著高于对照组。【结论】家蚕感染BmNPV后,中肠、血淋巴和脂肪体ALP基因表达水平及碱性磷酸酶活性变化均是呈现先升高后急剧减弱的趋势。基因的表达情况与酶活性变化规律一致,这与家蚕感染BmNPV后,其自身机体的生理代谢进程存在紧密联系,暗示碱性磷酸酶在家蚕抗病毒过程中发挥了重要作用。     

家蚕免疫负调控分子BmFAF的功能

【目的】在细胞和个体水平上探讨家蚕BmFAF的免疫负调控功能,为研究昆虫免疫稳态提供参考。【方法】通过RT-PCR技术克隆BmFAF并进行结构域预测和分析;利用荧光定量PCR检测BmFAF在家蚕各龄期以及5龄第3天幼虫的各组织中的时空表达特征和家蚕感染细菌后的免疫诱导表达特征;构建BmFAF的细胞表达载体以及合成用于RNAi的dsRNA,通过质粒或dsRNA的转染在BmE细胞中过表达BmFAF或降低BmFAF的表达水平,并利用Western blotting或定量PCR予以确认,同时检测抗菌肽基因表达水平的变化;通过注射dsRNA在个体中降低BmFAF的表达水平,并检测BmFAF对抗菌肽基因表达水平和家蚕感染细菌后存活率的影响。【结果】BmFAF与其他物种FAF家族成员有较高的同源性,与人类HsUBXD8、HsFAF1和果蝇DmCaspar分别具有60%、42%和47%的相似性,并具有保守的UBX结构域。时空表达特征分析表明,除生殖腺外,BmFAF在免疫组织中表达量略高于其他组织,眠蚕期表达量显著高于起蚕期,尤其在2龄和3龄眠蚕中的表达量最高;5龄时BmFAF的表达量普遍较低,而从5龄发育至预蛹期时,BmFAF的表达水平有所上升。免疫诱导表达谱显示,家蚕在注射感染黑胸败血芽孢杆菌或黏质沙雷氏菌0.5 h后,脂肪体中BmFAF的表达水平即显著下降,且在12 h内没有恢复,而抗菌肽BmCecropinA1的表达则持续上升,并在12 h时达到最高。在BmE细胞中过表达BmFAF,抗菌肽BmCecropinA1、BmAttacin和BmMoricin的表达水平与转染对照质粒的细胞中的抗菌肽相比,均显著降低。在细胞中转染dsRNA后,BmFAF的表达水平被有效地降低50%-60%,抗菌肽BmCecropinA1和BmMoricin的表达水平与对照相比均显著升高。对5龄第2天家蚕幼虫注射dsRNA,24 h后通过荧光定量PCR检测到BmFAF的表达水平在注射dsFAF的家蚕中下降至注射dsEGFP对照中的45%;而抗菌肽BmCecropinA1和BmMoricin、BmAttacin的表达水平均被显著上调。这些家蚕通过注射感染黏质沙雷氏菌24 h后,死亡率即低于对照组,在感染72 h后仍有40%左右的家蚕存活,而对照组中则无家蚕存活。【结论】结构分析、表达特征以及细胞和个体水平上的功能研究表明,BmFAF是一个具有免疫负调控作用的分子,通过抑制抗菌肽的表达维持家蚕免疫稳态, 而降低BmFAF的表达水平则导致抗菌肽表达水平升高,从而有助于减缓甚至避免家蚕在感染细菌后的死亡。     

家蚕肠道感染细菌后6种抗菌肽基因表达的变化

【目的】研究感染绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)后,家蚕中肠和脂肪体中6种抗菌肽基因表达的变化,为家蚕肠道免疫研究提供一定的理论依据。【方法】给家蚕喂食感染绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌,以喂生理盐水为对照,利用半定量RT-PCR方法,检测感染不同时间(1,2,4,8,16,24h)后中肠和脂肪体中6种抗菌肽基因表达的变化。【结果】喂食绿脓杆菌1,2h后,中肠中抗菌肽Gloverin2、Lebocin、CecropinB6、CecropinD和Moricin的相对表达量显著上调;喂食金黄色葡萄球菌1,2,4h后,中肠中6种抗菌肽的相对表达量均显著上调。在脂肪体中,感染两种细菌后,仅抗菌肽CecropinD、Moricin和Attacin2相对表达量的变化较为显著。【结论】家蚕在感染不同细菌后所诱导的免疫机制不同。细菌经由口器进入家蚕肠道,可同时引起上皮免疫反应和体液免疫反应。     

家蚕感染球孢白僵菌后4种抗菌肽基因的表达分析

【目的】阐明家蚕(Bombyxmori)抗菌肽对球孢白僵菌感染的应答模式,为揭示家蚕及鳞翅目昆虫抗真菌机制提供参考依据。【方法】利用实时荧光定量PCR检测家蚕被球孢白僵菌感染后抗菌肽基因cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme的表达情况,比较4种抗菌肽在家蚕脂肪体、血淋巴、马氏管和中肠中不同时间点的表达差异。【结果】经球孢白僵菌诱导后,cecropinA基因在家蚕脂肪体中的最高上调表达倍数为10.2倍,在血淋巴中的最高上调表达倍数为13.2倍,在马氏管中感染初期显著上调表达(P<0.05,下同),在中肠中感染后期显著上调表达;gloverin2基因在家蚕脂肪体中出现2次上调表达过程,最高上调表达倍数为15.7倍,在血淋巴中感染前期呈上调表达,在马氏管中略呈下调表达,中肠中的gloverin2基因在接种后16~48 h呈显著上调表达,最高上调表达倍数为6.7倍;lebocin1/2基因在家蚕脂肪体和血淋巴中的最高上调表达倍数分别为19.4和22.4倍,在马氏管中仅在接种后16 h呈显著上调表达,在中肠中则是接种后24~48 h呈显著上调表达;lysozyme基因在家蚕脂肪体中显著上调表达,在血淋巴和马氏管中感染初期也呈显著上调表达,但在中肠中的表达无明显规律。【结论】cecropinA、gloverin2、lebocin1/2和lysozyme基因在球孢白僵菌侵染家蚕的过程中均不同程度地被诱导上调表达,尤其在家蚕脂肪体和血淋巴中较明显,由此推测这4种抗菌肽在抵御球孢白僵菌的侵染过程中发挥重要作用。     

家蚕β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1表达特征及其对激素的响应

【目的】探究BmSuc1基因在家蚕不同组织及不同时期的表达特征及经昆虫激素处理后的表达变化规律,明确昆虫激素对BmSuc1基因的调控作用,为深入解析BmSuc1基因的功能及其表达调控机制提供参考依据。【方法】利用实时荧光定量PCR检测BmSuc1基因在家蚕发育过程中不同时期和不同组织及外源激素处理后的表达特征,并通过双链RNA （dsRNA）干扰试验检测家蚕20-羟基蜕皮素（20E）受体基因（USP）干扰效果及BmSuc1基因的表达变化。【结果】BmSuc1基因在家蚕中肠中的相对表达量最高,其次是丝腺、表皮和血淋巴,在其他组织中的相对表达量很低或几乎不表达;BmSuc1基因呈脉冲型的表达模式,在家蚕每个龄期的将眠时、五龄后期（上簇前）及预蛹时的相对表达量较高。利用外源激素[20E和保幼激素（JH）]分别处理五龄第2 d发育良好的家蚕,发现经20E处理后12和18 h,BmSuc1基因相对表达量极显著高于注射0.1%二甲基亚砜（DMSO）的对照组（P<0.01,下同）,但在测定时间范围内JH处理组的BmSuc1基因相对表达量与对照组间无显著差异（P>0.05）。以体外转录合成USP基因的dsRNA注射五龄第3 d家蚕,注射后24和36 h,USP基因相对表达量极显著下调,即dsRNA干扰成功。利用RNAi技术干扰USP基因能阻断20E信号转导,致使BmSuc1基因表达受抑制,其相对表达量在干扰USP基因后24和36 h显著下调（P<0.05）。【结论】BmSuc1基因主要在家蚕蜕皮和变态时高表达,暗示其可能参与家蚕的变态发育过程。添加外源20E可诱导BmSuc1基因转录,而阻断20E信号转导途径会抑制BmSuc1基因表达,即BmSuc1基因作为20E信号转导通路中的下游靶基因,直接或间接受到20E信号调控。     

家蚕BmCaspase-8-Like(BmCasp8L)的免疫负调控功能

【目的】在个体和细胞水平上探讨家蚕(Bombyx mori)BmCaspase-8-Like(BmCasp8L)的免疫负调控功能,为研究昆虫免疫负调控机制提供参考。【方法】通过RT-PCR技术克隆BmCasp8L并进行结构域预测和进化分析;利用荧光定量PCR检测BmCasp8L在家蚕各龄期、5龄第3天及预蛹期各组织中的时空表达特征和家蚕感染细菌后的免疫诱导表达特征;合成用于RNAi的dsRNA,通过注射dsRNA在个体中降低BmCasp8L的表达水平,并检测对抗菌肽基因表达水平的影响;构建BmCasp8L的细胞表达载体,通过质粒或dsRNA的转染在BmE细胞中过表达BmCasp8L或降低BmCasp8L的表达水平,并利用Western blot或定量PCR予以确认,同时检测抗菌肽基因表达水平的变化及转录因子BmRelish的切割。【结果】BmCasp8L与鳞翅目Caspase-6、哺乳动物Caspase-8同源,其序列与BmDredd、DmDredd N端分别具有61%、42%的相似性,但缺少C端的Caspase结构域。时空表达特征分析表明,BmCasp8L在眠蚕期表达量高于起蚕期,在预蛹期、蛹第7天、蛾第1天表达量明显升高;在5龄第3天幼虫体内,BmCasp8L在血细胞中的表达量明显高于其他组织,而在预蛹期,BmCasp8L主要在丝腺中表达。免疫诱导表达谱显示,5龄第3天家蚕在注射感染黑胸败血芽孢杆菌或粘质沙雷氏菌1 h内,BmCasp8L的表达水平上升,此后逐渐恢复正常。对5龄第2天家蚕注射dsCasp8L或dsEGFP,24 h后通过荧光定量PCR检测到BmCasp8L的表达量在注射dsCasp8L的家蚕中显著下调,而抗菌肽BmCecropinA1的表达水平显著上调。在BmE细胞中过表达BmCasp8L,抗菌肽BmCecropinA1的表达水平与对照相比显著降低,且转录因子BmRelish的切割受到抑制。在细胞中转染dsRNA后,BmCasp8L的表达水平被有效降低,抗菌肽BmCecropinA1的表达水平显著上调。【结论】进化分析、表达特征以及细胞和个体上的功能研究表明BmCasp8L是一个具有免疫负调控作用的分子,通过抑制BmRelish的切割,抑制抗菌肽的表达,从而负调控Imd信号通路,降低BmCasp8L的表达水平则导致抗菌肽表达水平升高,有助于家蚕抵御微生物病原的侵染。     

5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因转录表达分析

【目的】探明5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因表达及其酶活性变化规律,为解析家蚕回避桑叶1-脱氧野尻霉素(DNJ)毒害作用的适应机制提供参考依据。【方法】通过实时荧光定量PCR对5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因Bm Suc1和Bm Suc2的表达进行定量检测和分析,同时测定β-呋喃果糖苷酶活性。【结果】Bm Suc1基因在5龄家蚕中肠的不同发育阶段均有表达,其中在5龄起蚕和盛食期的相对表达量较高;而Bm Suc2基因在整个5龄期的相对表达量均非常低。从5龄起蚕到熟蚕,β-呋喃果糖苷酶活性呈先升高后降低的变化趋势,以第5 d(盛食期)的酶活性最高,达158.82U/mg。【结论】Bm Suc1基因表达水平及β-呋喃果糖苷酶活性变化规律与5龄家蚕吸收利用桑叶蔗糖营养的生理进程基本一致,提示Bm Suc1基因作为一种蔗糖水解酶基因在家蚕中肠组织消化吸收桑叶蔗糖营养物质的过程中发挥主导作用。     

细胞周期蛋白家族基因在家蚕幼虫蜕皮过程中的表达

细胞周期蛋白(cyclin)是调控真核生物细胞有丝分裂的重要蛋白。以家蚕1~5龄幼虫的眠蚕和起蚕为材料,采用实时荧光定量PCR方法对家蚕cyclin家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE)在不同龄期幼虫蜕皮过程中的表达进行研究。结果显示,1龄幼虫在眠期、起蚕期几乎均检测不到CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的表达,表明此时幼虫器官发育基本完成,细胞分裂迟缓。在起蚕期,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均随着幼虫的发育进程逐渐增加,表明细胞分裂过程加剧,促进家蚕个体的不断生长;眠期则没有规律性变化。在2~5龄幼虫中,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均为起蚕期高于眠期,眠期最重要的生理过程是细胞凋亡,因此眠期细胞周期蛋白家族基因表达水平较低,而CyclinB3基因在整个幼虫时期几乎不表达。本试验结果为细胞周期蛋白在家蚕蜕皮变态发育过程中的调控机制研究提供了参考。     

BmNPV对家蚕抗氧化酶基因表达及其酶活性的影响

[目的]探究喂食家蚕核型多角体病毒(BmNPV)后家蚕血淋巴和中肠组织抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)]的活性及其基因表达变化规律,明确BmNPV侵染对家蚕抗氧化系统的影响,为解析BmNPV的致病机理提供理论依据.[方法]以五龄家蚕为研究对象,经口喂食BmNPV,分别于添食后6、12、18、24、30、36、42和48 h采集家蚕的血淋巴和中肠组织,采用实时荧光定量PCR检测两种抗氧化酶基因(Bmsod和Bmcat)的表达水平,同时以抗氧化酶活性测试盒测定SOD和CAT的活性变化情况.[结果]BmNPV侵染五龄家蚕能引起典型的血液型脓病,主要表现为蚕体环节肿胀,狂躁爬行,体壁易破,体液呈乳白色等.家蚕血淋巴和中肠组织中Bmsod和Bmcat基因均在感染BmNPV中期开始上调表达,在感染后期呈下调表达趋势,其相对表达量也呈先增加后急剧减少的变化趋势.添食BmNPV后,家蚕血淋巴和中肠组织的SOD活性在感染18和24 h时极显著高于对照组(添食等量灭菌水)家蚕(P<0.01,下同),但从感染30 h起SOD活性开始急剧下降,至感染48 h时降至最低值.家蚕血淋巴和中肠组织的CAT活性在感染早期(6 h)略有下降,从感染12 h起CAT活性开始呈上升趋势,血淋巴CAT活性在感染18~30 h极显著高于对照组,随后急剧下降且显著低于对照组家蚕(P<0.05,下同);中肠组织CAT活性仅在感染18和24 h时显著或极显著高于对照组家蚕,从感染30 h起开始持续下降,至感染48 h时降至最低值,约为对照组家蚕的18%.[结论]BmNPV侵染能影响家蚕机体相关保护酶活性及其基因转录水平,SOD和CAT活性及其基因表达量在感染中期增加,感染后期则急剧降低,提示抗氧化酶SOD和CAT在家蚕的抗病毒过程中发挥重要作用.     

家蚕幼虫各发育时期酚氧化酶原基因的转录活性分析

[目的]为进一步了解家蚕酚氧化酶原基因的功能奠定基础。[方法]根据GenBank上登录的家蚕酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的cDNA序列设计2对特异引物,通过半定量RT-PCR技术检测家蚕幼虫各发育时期(蚁蚕到5龄起蚕)酚氧化酶原基因的转录活性。[结果]PPO1和PPO2基因在家蚕幼虫各发育时期的转录活性存在较大差异。PPO1基因在2龄眠蚕、4龄眠中的表达量最高,其次是2龄起蚕、3龄眠蚕3、龄起蚕和1龄眠蚕,在3龄眠中、4龄起蚕的表达量较低,在4龄眠蚕有弱表达,在其他发育时期几乎无表达。PPO2基因除了在蚁蚕1、龄眠中、2龄眠蚕无表达外,在其他时期的表达量均较高。[结论]酚氧化酶原基因在家蚕幼虫各发育时期的转录表达均具有明显的时空特异性。     

融合6个组氨酸的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在家蚕幼虫中的表达

将融合6个组氨酸(6×his)序列的hGM-CSF基因插入杆状病毒转移载体pBacPAK8中得到杆状病毒重组转移载体pBacPAKHis-GM-CSF,pBacPAKHis-GM-CSF DNA与线性化病毒BmBacPAK6 DNA共转染BmN细胞,获得了表达rhGM-CSF融合蛋白的重组病毒vBacPAKHis-GMCSF.用重组病毒感染家蚕五龄起蚕,分别在24、48、72、96、120 h和144 h剪腹足取蚕血淋巴,ELISA法测得rhGM-CSF融合蛋白在120 h的蚕血淋巴中表达量最高,约为15μg/mL蚕血淋巴.融合蛋白通过Poly-His Protein Purification Kit纯化.SDS-PAGE和Western blotting分析表明,表达产物是3种糖基化程度不同的,分子量分别约为18、20、31 kD的蛋白质.     

家蚕中肠特异启动子BmAPN的克隆及活性分析

【目的】克隆和鉴定1个家蚕中肠特异启动子,为研究家蚕的免疫应答和应用研究提供新的工具。【方法】从家蚕品种大造中提取基因组总DNA,用PCR方法克隆家蚕中肠特异表达基因BmAPN（GenBank登录号：BAA33715.1）的上游调控序列。利用此序列构建以EGFP为报告基因的转基因表达载体pBac[BmAPN-EGFP-SV40,3×P3-DsRed],通过显微注射获得转基因家蚕,在个体水平上检测启动子的活性。【结果】所克隆的BmAPN启动子长度为1 598 bp,其驱动的EGFP仅在转基因家蚕中肠特异表达,与内源基因BmAPN的表达特征一致。该启动子在家蚕幼虫时期活性相对较高,且在起蚕期的活性要明显高于眠蚕期,推测该启动子中的特异元件受激素调控。【结论】经克隆获得的BmAPN启动子为有活性的启动子,且为家蚕中肠特异启动子。     

辛硫磷对家蚕细胞周期蛋白家族基因转录活性的影响

【目的】探讨经辛硫磷诱导后,家蚕细胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE)在5龄幼虫各种组织中的转录活性,为进一步研究有机磷农药对家蚕的损伤机制提供参考。【方法】采用实时荧光定量PCR方法,以饲喂清水浸泡过的桑叶为对照,分析家蚕5龄3d幼虫喂食辛硫磷(4μg/mL)浸泡桑叶24h后,脑、脂肪体、中肠、丝腺、马氏管、精巢及卵巢等7种组织中4种细胞周期蛋白家族基因的转录水平。【结果】与对照组相比,辛硫磷诱导24h后,CyclinA、CyclinB、CyclinB3在各组织中均表达上调,CyclinE在中肠及脂肪体中表达显著下调,在精巢与马氏管中无明显变化,在其他组织中则表达上调。【结论】辛硫磷诱导24h后,家蚕组织中CyclinA、CyclinB及CyclinB3基因表达上调,这可能是家蚕对磷胁迫的响应;CyclinE在中肠及脂肪体中表达显著下调,这与这2种器官是家蚕重要的解毒代谢器官有关。     

昆虫激素对家蚕血淋巴和体壁酚氧化酶活性及其基因表达水平的影响

[目的]研究外源昆虫激素对家蚕酚氧化酶活性及其基因表达水平的影响,明确昆虫激素对酚氧化酶的调控作用,为深入解析家蚕酚氧化酶的功能及基因表达调控机制提供参考依据.[方法]对五龄第3d发育良好的家蚕幼虫注射蜕皮激素20E和保幼激素JH,以注射等量0.1%二甲基亚砜(DMSO)为对照,分别在注射3、6、12和24 h后解剖家蚕幼虫采集血淋巴和体壁,检测分析家蚕酚氧化酶活性及其基因表达的变化情况.[结果]注射外源JH和20E均能促进家蚕血淋巴酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的表达,有效增加酚氧化酶活性.家蚕血淋巴PPO1和PPO2基因对JH和20E的响应时间存在一定差异,其中,经JH处理后2个酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)仅在处理6和12 h时显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调表达;而经20E处理后PPO1和PPO2基因从3 h开始一直持续到12 h均呈上调表达趋势.JH和20E对家蚕体壁PPO1和PPO2基因的影响恰好相反,具体表现为:JH能有效抑制家蚕体壁PPO1和PPO2基因的表达,降低酚氧化酶活性;20E则促进家蚕体壁PPO1基因上调表达,但不影响PPO2基因表达.[结论]家蚕酚氧化酶原基因PPO1和PPO2表达受JH和20E的调控,且激素对酚氧化酶原基因表达水平的影响与其酶活性变化规律一致,提示酚氧化酶不仅参与昆虫激素的代谢,还与激素协同调控家蚕的蜕皮变态.     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI37的克隆、 表达及微生物诱导分析

【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。     

家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141的表达特征及对饥饿的响应

【目的】分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明确其时空表达模式,结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响,探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆,得到其编码区核苷酸序列;应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析;利用ClustalX1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析;构建原核表达载体p28-BmSP141,并转化到Rosetta（DE3）菌株中诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析;采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术,分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化;通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况;利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析。【结果】BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白,其中第1-17位氨基酸为信号肽,其成熟体蛋白预测分子量为25.9 kD,等电点为7.8。同源序列比对表明,BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高,分别达到62%和63%。这些同源序列具有保守的催化三联体,与活性相关的基序也很保守,但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比,BmSP141的底物特异性位点发生改变。在16和37℃条件下诱导后,重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白,并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体。组织和时期表达特征分析表明,该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达, 且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加,但眠期表达下降,蛹期和成虫期表达水平较低。Western blot分析也表明,BmSP141蛋白仅在家蚕中肠组织表达,且从5龄起蚕到上蔟表达量先增加后降低。免疫荧光定位结果表明,BmSP141定位于中肠上皮细胞的细胞质中,进一步证实BmSP141在中肠特异表达。在转录和翻译水平,BmSP141饥饿处理后表达量显著下调,而重新喂食后其表达量上调,表明BmSP141的表达受到消化道食物的诱导。【结论】家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141在中肠组织表达,在幼虫期食桑期高表达,蛹期和成虫期表达水平较低,受消化道食物的诱导而上调表达,推测该基因可能参与家蚕中肠的消化过程。     

家蚕中肠组织感染质型多角体病毒的应答基因分析

 【目的】筛选家蚕（Bombyx mori）中肠感染质型多角体病毒的应答基因,为阐明家蚕感染质型多角体病的分子机制奠定基础。【方法】 应用含有约23 000个家蚕基因组寡核苷酸芯片比较分析感染家蚕质型多角体病毒24、48及72 h的中肠试验组与中肠对照组的差异表达基因;结合生物信息学工具对差异表达基因的功能注释、分类及涉及的信号通路等进行分析;应用实时荧光定量PCR验证17个基因的差异表达。【结果】 在感染24、48及72 h后,分别得到了9、51及258个差异表达基因。KEGG通路分析表明,在感染48及72 h后,大多数涉及到代谢通路的基因的表达水平下调,所有涉及到核糖体通路和蛋白酶体通路的基因的表达水平上调。一些免疫相关基因如丝氨酸蛋白酶抑制剂、脂酶、热激蛋白、细胞色素P450、核糖体P0蛋白等基因的表达水平上调。【结论】经荧光定量PCR验证的差异表达基因可能与家蚕感染质型多角体病毒的应答机制相关,研究结果为从分子水平上阐明家蚕感染质型多角体病毒的致病机理提供了新的研究方向。     

BmNPV对家蚕BmN细胞周期及周期蛋白基因表达水平的影响

【目的】研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedroviruses,BmNPV)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞周期及细胞周期蛋白基因转录水平的影响。【方法】用BmNPV感染家蚕BmN细胞,分别在病毒感染后的不同时间(12,24,36,48h),应用实时荧光定量PCR方法检测细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB、CyclinE的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。【结果】BmNPV感染24h后,BmN细胞出现明显感染症状,变为圆形;48h后细胞核内出现多角体。随着感染时间的延长,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均下降,分别在感染12,24,36h后,表达量降低为0。流式细胞仪检测结果显示,在BmNPV感染后24h左右,抑制于G2/M期的BmN细胞达到68%。【结论】BmNPV感染家蚕BmN细胞后,导致CyclinB、CyclinE基因表达量降低,对CyclinA基因表达量的影响较小;同时BmNPV感染可以将BmN细胞发育抑制于G2/M期。