猪布鲁菌感染对巨噬细胞泛素蛋白酶体功能的影响

巨噬细胞(macrophage,M_φ)是布鲁菌的主要宿主细胞,为了探明布鲁菌感染与M_φ泛素-蛋白酶体功能之间的关系,本试验在应用蛋白酶体抑制剂Lactacystin与促进剂IFN-γ的基础上,对M_φ感染猪种布鲁菌S2株(Brucella suis,B.suis)后细胞上清中泛素、蛋白酶体及胞内B.suis数量进行了检测。结果显示,IFN-γ与Lactacystin对M_φ泛素的表达均有明显的促进作用,且IFN-γ效果显著优于Lactacystin;其次IFN-γ有效促进了M_φ蛋白酶体的表达,而Lactacystin显著抑制了M_φ蛋白酶体的表达。在此基础上,将B.suis感染不同状态的M_φ,在0.5~24h分别进行胞内B.suis计数,研究表明,一方面B.suis的感染促进了M_φ泛素及蛋白酶体的表达;另一方面,泛素蛋白酶体系统功能的增强,显著降低了B.suis的早期感染,但对于B.suis感染中后期作用不明显,而感染后期抑制M_φ蛋白酶体功能,却可显著降低B.suis的胞内增殖能力。     

布鲁菌感染早期抗免疫机制研究进展

布鲁菌引起的布鲁菌病在我国被列为二类动物疫病之首。虽然宿主本身具有复杂的免疫机制,用以抵御病原体,并保持宿主抗性和布鲁菌毒力之间的平衡,但布鲁菌作为一种成功的细胞内病原体,已经进化出多种策略来逃避免疫应答并在宿主内建立持续感染和繁殖。论文将从布鲁菌的毒力因子、布鲁菌在先天性免疫和适应性免疫系统中隐身策略,以及布鲁菌调控并抑制细胞凋亡、布鲁菌微小RNA(mircoRNA)在宿主免疫应答中的研究进展等方面进行综述,为了解布鲁菌病发病机理、开发新型疫苗和治疗布鲁菌病提供参考。     

泛素相关修饰蛋白SUMO-2对RAW264.7细胞内布鲁氏菌16M存活的影响

为探究泛素相关修饰蛋白SUMO-2对布鲁氏菌16M的影响,本试验构建了SUMO-2基因干扰和过表达小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,并用布鲁氏菌16M进行侵染。参照GenBank中SUMO-2基因序列设计特异性干扰片段和过表达引物,克隆成功后连接至相应的慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,选取阳性克隆菌提取质粒转染HEK-293FT细胞,将重组的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用布鲁氏菌16M分别侵染构建成功的干扰和过表达细胞模型。通过实时荧光定量PCR检测SUMO-2 mRNA的转录水平,Western blotting检测SUMO-2蛋白的表达,ELISA检测IFN-γ和TNF-α水平,菌落计数来确定布鲁氏菌在细胞中的存活能力。结果显示,与对照组相比,干扰组SUMO-2 mRNA水平极显著降低（P<0.01）,过表达组SUMO-2 mRNA水平极显著升高（P<0.01）,成功构建了SUMO-2干扰和过表达细胞模型。Western blotting结果显示,布鲁氏菌16M感染能以时间依赖的方式下调SUMO-2蛋白的表达。经菌落计数后发现,SUMO-2过表达后布鲁氏菌的数量极显著减少（P<0.01）,抑制布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。而SUMO-2干扰后布鲁氏菌的数量显著或极显著增加（P<0.05;P<0.01）,促进布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。同时,经SUMO-2过表达后,IFN-γ和TNF-α水平极显著升高（P<0.01）。经SUMO-2干扰后,TNF-α水平显著降低（P<0.05）,IFN-γ水平极显著降低（P<0.01）,SUMO-2在RAW264.7细胞中的表达变化也影响IFN-γ和TNF-α的产生。综上所述,SUMO-2蛋白在布鲁氏菌胞内存活中起着重要作用,可能有助于阐明布鲁氏菌感染的致病机制。     

泛素相关修饰蛋白SUMO-2对RAW264.7细胞内布鲁氏菌16M存活的影响

为探究泛素相关修饰蛋白SUMO-2对布鲁氏菌16M的影响,本试验构建了SUMO-2基因干扰和过表达小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,并用布鲁氏菌16M进行侵染。参照GenBank中SUMO-2基因序列设计特异性干扰片段和过表达引物,克隆成功后连接至相应的慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,选取阳性克隆菌提取质粒转染HEK-293FT细胞,将重组的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用布鲁氏菌16M分别侵染构建成功的干扰和过表达细胞模型。通过实时荧光定量PCR检测SUMO-2 mRNA的转录水平,Western blotting检测SUMO-2蛋白的表达,ELISA检测IFN-γ和TNF-α水平,菌落计数来确定布鲁氏菌在细胞中的存活能力。结果显示,与对照组相比,干扰组SUMO-2 mRNA水平极显著降低(P0.01),过表达组SUMO-2 mRNA水平极显著升高(P0.01),成功构建了SUMO-2干扰和过表达细胞模型。Western blotting结果显示,布鲁氏菌16M感染能以时间依赖的方式下调SUMO-2蛋白的表达。经菌落计数后发现,SUMO-2过表达后布鲁氏菌的数量极显著减少(P0.01),抑制布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。而SUMO-2干扰后布鲁氏菌的数量显著或极显著增加(P0.05;P0.01),促进布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。同时,经SUMO-2过表达后,IFN-γ和TNF-α水平极显著升高(P0.01)。经SUMO-2干扰后,TNF-α水平显著降低(P0.05),IFN-γ水平极显著降低(P0.01),SUMO-2在RAW264.7细胞中的表达变化也影响IFN-γ和TNF-α的产生。综上所述,SUMO-2蛋白在布鲁氏菌胞内存活中起着重要作用,可能有助于阐明布鲁氏菌感染的致病机制。     

深度测序技术分析小鼠巨噬细胞感染布鲁菌16M株的转录组学变化

布鲁菌病是由布鲁菌引起的一种人兽共患性传染病,曾被用作生物恐怖战剂。本研究利用深度测序技术对布鲁菌感染小鼠巨噬细胞RAW264．7的转录组学轮廓进行了描述。在感染后4h,筛选出差异表达基因3576个,其中58％的基因表现上调;在感染后24h,筛选出差异表达基因3962个,其中45％的基因表现上调。并且在感染后24h内,变化显著的基因都是与炎症、免疫、吞噬、凋亡紧密相关的。进而我们分析了在感染后24h内显著变化的代谢途径,这些代谢途径包括内质网代谢途径、溶酶体代谢途径、及与凋亡相关的代谢途径;及被显著富集的信号通路,这些信号通路包括凋亡通路、NOD受体信号通路、Fc γR介导的吞噬通路、溶酶体信号通路、p53信号通路、内质网相关蛋白的通路;并且发现B细胞受体和toll样受体信号通路在感染后24h与感染后4h相比被显著富集。本研究建立的巨噬细胞感染布鲁菌后差异表达基因数据库,将为布鲁菌致病机制的逐步阐述奠定基础。     

基于iTRAQ技术伪狂犬病毒感染宿主细胞差异表达蛋白质组分析

为了研究伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)感染宿主细胞后宿主蛋白的差异表达情况,寻找PRV与细胞相互作用的重要分子,本试验将PRV接种PK-15细胞,运用同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合色谱/串联质谱联用技术,开展病毒感染细胞后差异表达蛋白分析,并通过qPCR对其数据进行验证。以未接毒细胞为对照,通过数据库检索,分析出3 062个蛋白,共鉴定到27个差异表达蛋白,其中21个蛋白下调,6个蛋白上调。这些差异蛋白主要参与代谢过程、生物调控、应激反应以及定位等生物学过程,具有结合活性、催化活性、转录活性等分子功能。NFκB1、PIK3R2、HSPA1L等差异蛋白在多条通路中发挥作用。POP1、UTP15和ND4的表达变化情况与iTRAQ结果变化趋势一致,证明了该数据的可靠性。本试验研究结果为进一步研究PRV致病机制及宿主免疫应答提供理论依据。     

野生动物感染布鲁菌的研究进展

布鲁菌病是一种分布广泛的重要人兽共患病,多年来已经证实许多种类的陆地野生动物和海洋哺乳动物存在布鲁菌感染.目前已经鉴定了9种布鲁菌,能感染野生动物并呈现临床病症的致病性布鲁菌种包括羊种布鲁菌(B.melitensis)、猪种布鲁菌(B.suis)、牛种布鲁菌(B.abortus)、犬种布鲁菌(B.canis)、沙林鼠布鲁菌(B.neotomae)等5种,可感染野牛、鹿、羚羊、野兔、海豚和鲸等动物,并具有或潜在具有传播给人类的能力.论文重点对野牛、野羊、野猪、野鹿、野鼠、狐狸、骆驼、北极熊、海豚和海豹等动物布鲁菌感染状况的研究进展进行综述,表明这些动物均能易感并表现不同的布鲁菌病临床病症.野生动物布鲁菌病的发生与家畜和人的布鲁菌病防控密切相关,必须予以关注.     

羊布鲁菌强毒株16M与疫苗株M5外膜蛋白蛋白质组学研究

通过比较蛋白质组学分析M5生存表型的改变所引起的蛋白图谱与强毒株的差异之处,根据这些差异表达蛋白的LC/MS-MS鉴定结果来分析疫苗株的致弱机制进而为寻找新的毒力相关分子、鉴别诊断分子以及揭示布鲁菌胞内寄生机制提供帮助。本研究利用比较蛋白质组学技术,对布鲁菌强毒株16 M和弱毒株M5的外膜蛋白进行了差异比较分析,结果共发现33个差异蛋白点,代表了26个开放阅读框,这些蛋白涉及了蛋白质的生物合成(5/26)、氨基酸合成(3/26),脂肪酸代谢(2/26)、能量代谢(5/26),以及细胞被膜生物合成(4/26)和一些调节系统(4/26)等多个生物过程。这些发现为研究外膜蛋白在布鲁菌毒力,胞内寄生等过程中发挥的重要作用提供了新依据。     

先天免疫受体在流产布鲁菌感染中的作用的研究进展

<正>1绪论传统意义上的免疫系统在体内的有效免疫分先天和后天免疫应答。后天免疫同先天免疫应答相比,对病原菌作出的反应速度较慢,且只对特殊抗原作出反应并具有免疫记忆性。相反,先天免疫反应则迅速,且肩负着抵抗病原菌第一道防线的功能。先天免疫包括机体表面的物理屏障,可溶性因子如补体蛋白,还包括多种细胞如巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细     

粗糙型布鲁菌M111菌壳的制备

将含有裂解酶基因重组温控裂解质粒pBBR1MCS∷PR-PL-E电转化至粗糙型布鲁菌M111中,构建重组布鲁菌M111(pBBR1MCS∷PR-PL-E)。重组菌株在28℃培养,42℃诱导表达裂解酶E,从而制备布鲁菌菌壳。绘制布鲁菌生长曲线及裂解曲线,计算裂解率并用透射电镜观察布鲁菌菌壳的形态。结果显示,成功制备了布鲁菌菌壳,温控裂解质粒pBBR1MCS∷PR-PL-E对布鲁菌的裂解率为100%。透射电镜观察可见细菌内容物部分流出,细菌表面出现不同程度的皱缩,细胞形态发生变化。结果表明,本试验成功制备了粗糙型布鲁菌菌壳,初步研究了其基本特性,为下一步开展布鲁菌菌壳疫苗的研究奠定了基础。     

粗糙型布鲁菌M111菌壳的制备

将含有裂解酶基因重组温控裂解质粒pBBR1MCS：：PR-PL-E电转化至粗糙型布鲁菌M111中,构建重组布鲁菌M111（pBBRlMCS：：PR-PL-E）。重组菌株在28℃培养,42℃诱导表达裂解酶E,从而制备布鲁菌菌壳。绘制布鲁菌生长曲线及裂解曲线,计算裂解率并用透射电镜观察布鲁菌菌壳的形态。结果显示,成功制备了布鲁菌菌壳,温控裂解质粒pBBRIMCS：：PR-PL-E对布鲁菌的裂解率为100％。透射电镜观察可见细菌内容物部分流出,细菌表面出现不同程度的皱缩,细胞形态发生变化。结果表明,本试验成功制备了粗糙型布鲁菌菌壳,初步研究了其基本特性,为下-步开展布鲁菌菌壳疫苗的研究奠定了基础。     

宠物犬感染布鲁菌的诊断报告

<正>布鲁菌病是由布鲁菌引起的一种人兽共患传染病,以侵害生殖系统为主要特征的传染性疾病。主要表现为睾丸炎、附睾炎、流产、不育等特征。犬种布鲁菌属于粗造型菌株,主要引起犬类发病,导致母犬流产、公犬睾丸炎等。流产后的母犬常表现为子宫内膜炎,出现屡配不孕。公犬感染后,以睾丸炎、附睾炎、前列腺炎、包皮炎等。潜伏期一般为两周至半年。现将1例宠物犬感染布鲁菌病的诊断情况报告如下。1基本情况1.1患犬资料来自东北某种犬养殖场,犬年龄2     

重组AcMNPV感染家蚕后造成宿主组织液化的机制分析

杆状病毒的组织蛋白酶(V-CATH)和几丁质酶(V-CHIA)是病毒感染宿主后造成宿主组织液化的关键酶。家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染家蚕后会导致宿主组织的液化,而苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)感染家蚕后不会造成宿主组织的液化。为了分析AcMNPV不造成家蚕宿主组织液化的原因,利用Bac-to-Bac系统将BmNPV的v-cath(Bmcath)、v-chiA(BmchiA)同时或分别重组到AcMNPV的极晚期强启动子p10和polh下游,并以同样的方法将AcMNPV的v-cath(Accath)、v-chiA(AcchiA)同时或分别重组到AcMNPV的p10和polh下游,从而构建6种重组AcMNPV。结果显示6种重组AcMNPV均能感染家蚕,并造成家蚕宿主组织的液化,说明重组AcMNPV中v-cath和v-chiA的过量表达在病毒对家蚕组织液化过程中发挥了重要作用。通过对感染6种重组AcMNPV之间的蚕体液化发生时间和液化率进行比较,发现相对于v-chiA,v-cath对组织液化的作用可能更加直接。检测比较感染AcMNPV和重组AcMNPV家蚕血淋巴中的组织蛋白酶和几丁质酶活性,两种酶的活性均随v-cath和v-chiA基因拷贝数的增加而增加。AcMNPV感染后不会造成家蚕宿主组织液化可能是由于病毒的组织蛋白酶活性太低,而不是由Bmcath和Accath、BmchiA和AcchiA之间的序列差异造成的。     

蛋白翻译后泛素化修饰在精子发生中作用机制的研究进展

泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System,UPS）是真核细胞内蛋白质降解的2种主要机制之一。在精子发生过程中许多蛋白质和细胞器被降解,UPS在促进精子形成的过程中起着关键作用。在精子发生的减数分裂、顶体生物发生和精子成熟等关键阶段,泛素相关成分（包括去泛素化酶）发挥着积极作用。一般来说,UPS功能障碍会阻止精子发生,这可能会在不同程度上诱发不育。许多UPS成分可以在不同水平上调节精子发生。本文综述了精子发生过程中泛素化修饰研究进展,为后续研究提供新的见解。     

贵阳市家畜布鲁菌感染情况调查与分析

为了解贵阳市2015年家畜布鲁菌的感染情况,以指导全市家畜布鲁菌病的防控工作,采用虎红平板凝集试验和试管凝集试验对全市8 381份牛、羊、猪血清开展布鲁菌感染情况调查。结果表明,牛、羊和猪布鲁菌病阳性率依次为0.29%(13/4 530)、0.39%(11/2 848)和0%(0/1 003)。说明贵阳市家畜布鲁菌病的流行率在国家控制标准以内,今后宜实行检疫和扑杀相结合的防控策略。     

感染牛布鲁菌544A的巨噬细胞蛋白质组学分析

布鲁菌在巨噬细胞内寄生改变了巨噬细胞的很多结构和功能,对牛布鲁菌强毒株544A感染的巨噬细胞和未感染的巨噬细胞全细胞蛋白进行比较蛋白质组学分析,质谱鉴定和生物学信息检索,结果显示,共有13个差异蛋白点,代表了12种蛋白质,这些蛋白主要参与细胞的代谢,细胞骨架合成,蛋白损伤修复以及基因的转录调控等生物过程.这些蛋白的发现将为进一步研究布鲁菌的感染与致病机制提示方向,同时也为深入探讨病原菌与宿主的相互作用模式奠定了基础.     

PRV感染后对宿主先天免疫信号转导影响的研究进展

伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)是伪狂犬病(pseudorabies, PR)的病原体,感染大多数哺乳动物,自发现以来,已在世界各地流行,并给养猪业造成了巨大的经济损失。近年来,为预防和治疗PR,对PRV的致病机制进行了深入研究,在PRV感染后引起宿主先天免疫信号转导的变化,以及对宿主免疫反应的影响等方面都取得了一定进展,但仍有很多信号通路与病毒的作用机制还有待揭示。因此,本文以PRV感染后结合不同受体引起下游信号通路的变化为出发点,将病毒与宿主间相互作用的研究进展进行综述,以期为PRV致病机制和抗病毒药物的后续研究提供参考。     

粗糙型布鲁菌M111菌壳的安全性和免疫原性

以粗糙型布鲁菌M111株和重组裂解质粒制备出布鲁菌菌壳,利用小鼠模型对布鲁菌菌壳、布鲁菌M111活菌和福尔马林灭活菌的安全性和免疫原性进行比较研究。结果显示,与布鲁菌弱毒菌株M111比较而言,布鲁菌菌壳具有更好的安全性,免疫小鼠后能产生与弱毒菌株相似的血清抗体水平、脾CD3+和CD4+T淋巴细胞反应,甚至产生更高水平的IFN-γ。这些结果表明,布鲁菌菌壳具有与弱毒菌株相似的体液免疫和细胞免疫能力,将来可能作为预防布鲁菌感染的新型候选疫苗,但布鲁菌菌壳疫苗的有效性和特异性免疫机制还有待深入研究。     

布鲁菌S2疫苗株免疫牛与牛种、羊种布鲁菌自然感染牛ELISA鉴别诊断方法的建立

为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA—related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA—related融合蛋白,以repArelated蛋白建立间接EI．IsA检测方法。用repA—related蛋白间接ELISA检测猪种s2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA—related蛋白间接EusA能从试管凝聚实验（SAT）及常规ELIsA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出s2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。     

布鲁菌S2疫苗株免疫牛与牛种、羊种布鲁菌自然感染牛ELISA鉴别诊断方法的建立

为建立区分猪种布鲁菌S2疫苗株接种奶牛与布鲁菌自然感染奶牛,BLAST比对分析羊种、牛种、猪种、犬种、沙林鼠种和绵羊种6种布鲁菌基因序列,发现repA-related基因是猪种布鲁菌与牛种及羊种布鲁菌的差异基因。设计引物PCR扩增获得repA-related基因片段,克隆并原核表达得到了布鲁菌repA-related融合蛋白,以repA-related蛋白建立间接ELISA检测方法。用repA-related蛋白间接ELISA检测猪种S2疫苗株接种动物血清为阳性,检测牛种和羊种布鲁菌自然感染动物血清为阴性。repA-related蛋白间接ELISA能从试管凝聚实验(SAT)及常规ELISA检测阳性的奶牛血清样本中,区分出S2疫苗接种牛与牛种布鲁菌感染牛。