马铃薯StTrxF基因的克隆与功能分析

为探究马铃薯硫氧还蛋白基因(StTrxF)的耐盐生理机制,通过RT-PCR方法从马铃薯品种中薯5号中克隆得到全长549bp硫氧还蛋白基因(StTrxF)。该基因编码182个氨基酸,预测蛋白质分子量为44.17ku,理论等电点(pI)为5.23,具有典型的Thioredoxin结构域。由StTrxF基因推导的氨基酸序列与番茄、拟南芥、芝麻和赤霞珠等TrxF蛋白质氨基酸序列的同源性为96.02%～59.28%。构建植物过表达载体,导入拟南芥中,获得转基因拟南芥纯系植株。通过对转基因拟南芥植株的耐盐离体和盆栽鉴定,表明转基因植株的耐盐性显著提高。同时盐胁迫下,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)活性和脯氨酸含量显著提高,丙二醛(MDA)含量显著降低。结果表明,表达StTtxF基因通过增加转基因植株脯氨酸含量,提高SOD活性,降低MDA含量,以维持细胞渗透平衡并激活ROS清除系统,具有提高转基因拟南芥植株耐盐性的显著效果。     

共转化Atpsy和folE基因提高生菜类胡萝卜素和叶酸含量

通过农杆菌介导的遗传转化法将拟南芥八氢番茄红素合成酶基因(phytoene synthase,Atpsy)和按照拟南芥偏爱密码子人工合成的编码三磷酸腺苷环化水解酶(GTP cyclohydrolase,GCHI)的folE基因共同转入罗曼生菜中,通过Realtime-PCR、HPLC、干酪乳杆菌发酵法分别测定了转基因生菜中目标基因的表达量、叶黄素和β-胡萝卜素含量以及总叶酸含量。实验结果表明:转基因生菜中Atpsy基因表达量为野生型的43.54倍,folE基因表达量为野生型的38.05倍;转基因生菜植株叶黄素和β-胡萝卜素含量与野生型相比均有提高,含量最好的转基因植株L13中叶黄素含量为7.1mg/kg(鲜重,下同),是野生型对照6.8mg/kg的1.1倍,β-胡萝卜素含量为592.6mg/kg,是野生型对照196.9 mg/kg的3倍;叶酸含量最高是2 083.4 mg/kg,为野生型对照1 129.1mg/kg的1.85倍。该研究为通过基因工程手段改良类胡萝卜素和叶酸在植物体内的代谢途径,获得同时富含类胡萝卜素和叶酸的新型生菜品种打下了基础。     

石斑鱼生长激素基因的合成及其在拟南芥中的表达

为了使石斑鱼生长激素基因适合在植物中表达,重新合成了石斑鱼生长激素基因,对其密码子进行了优化,把合成的基因构建于植物表达载体pBI121上并转化模式植物拟南芥,获得了30个转基因抗性植株。对24株PCR阳性苗进行Northernblotting分析,结果表明,鱼类生长激素基因可以在转基因植物中表达,其表达在不同的转基因植株中存在明显差异,表达最强的植株与最弱的植株相比,二者表达量差异达到43倍。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ）,并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。     

一个耐镉基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究MNB1基因在植物应对镉胁迫响应中的功能,构建拟南芥中MNB1基因过量表达载体,通过筛选鉴定最终获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥c DNA为模板,PCR扩增MNB1基因全长,将该基因连接到过量表达载体上;然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,浸花法转化野生型植株;最后利用转基因筛选与遗传鉴定获得MNB1转基因阳性植株。[结果]MNB1基因CDS全长1 368 bp,酶切连接后转化大肠杆菌鉴定得到阳性菌落,测序结果经比对完全正确。通过抗性筛选及PCR电泳检测获得阳性转基因植株。[结论]MNB1基因过表达载体构建成功并获得相应转基因植株,为进一步研究该基因调控植物镉胁迫响应中的功能及其分子机制奠定基础。     

烟草转录因子基因NtGRAS-R1的克隆与功能分析

为了分析NtGRAS-R1的生物学功能,在NCBI上BLAST植物的EST数据库拼接获得Nt-GRAS-R1的全长序列;根据该序列设计特异引物,利用PCR方法从烟草根系cDNA 中扩增Nt-GRAS-R1,将其连接到pS1300表达载体上,采用农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥,采用RT-PCR法检测转基因拟南芥植株;获得稳定转基因拟南芥后观察生长性状,并用qPCR方法检测At-CLV3基因的表达情况。结果显示,NtGRAS-R1基因属于HAM亚家族,编码508个氨基酸;观察发现,转基因拟南芥植株根长和根体积明显大于野生型;qPCR结果表明,转基因拟南芥AtCLV3的表达量明显低于野生型拟南芥。初步表明NtGRAS-R1参与根系生长发育调控过程。     

烟草和拟南芥表皮毛中特异表达iaaM后的遗传效应

利用色氨酸单加氧酶基因iaaM与拟南芥表皮毛特异表达GL2基因启动子重组后,构建了在植物表皮毛细胞中特异表达iaaM基因的重组基因载体;采用根癌农杆菌叶盘转化法将重组基因转化到烟草WS38(对照)中,筛选和鉴定出了6株转化烟草植株;将该重组基因以根癌农杆菌花序浸渍法转至拟南芥(Colombia ecotype,对照),筛选出9株拟南芥转化植株,并对稳定转化的转基因植株表皮毛进行观察。结果表明:转基因烟草表皮毛较对照植株显著增长,其长度最长为对照的2.2倍,但转基因拟南芥表皮毛长度与对照间无显著差异。对烟草幼叶进行生长素浓度检测,转iaaM基因烟草吲哚乙酸含量显著提高,说明iaaM在烟草表皮毛细胞中表达,使其合成和积累更多的生长素;转基因拟南芥和烟草表皮毛密度均较对照显著增加,证明植物表皮毛发育模式中GL2表达的特异性受细胞内生长素的影响。     

FaGST基因过量表达获得拟南芥转基因植株

【目的】探明FaGST基因的功能和分子调控机制,为其后期的抗性利用与研究提供科学依据。【方法】利用前期构建的pCAMBIA1300-35S空载体和pCAMBIA1300-35S-FaGST过表达载体,将其转化感受态(DH5α)细胞后导入农杆菌GV3101,利用花序侵染法转化拟南芥,通过潮霉素(Hyp)进行筛选、PCR鉴定,并利用实时荧光定量PCR检测其表达量。【结果】FaGST基因成功导入拟南芥中,获得6株空载体转基因拟南芥植株和8株转FaGST基因拟南芥植株;8株转基因拟南芥植株的FaGST基因表达量为1.31～2.06,较野生型拟南芥植株表达量（1.00）显著或极显著提高。【结论】成功获得拟南芥转基因纯合植株,FaGST基因在拟南芥植株中已过量表达。     

紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达载体。[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的一对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,获得MsCOL1基因完整编码区DNA序列,并将目的片段插入表达载体pBI121的相应位置,构建植物表达载体35S∷MsCOL1,再利用农杆菌介导方法将35S∷MsCOL1转化到拟南芥中。[结果]分析测序结果显示,所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达。[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∷MsCOL1,并获得了转基因拟南芥植株。     

黄瓜酪氨酸硫化转移酶基因CsTPST克隆及其表达分析

【目的】克隆黄瓜酪氨酸硫化转移酶基因(CsTPST),并分析植物多肽在发育过程中的调控作用,为研究CsTPST的功能及多肽与乙烯在黄瓜发育过程中的相互作用打下基础。【方法】以拟南芥TPST蛋白序列信息为基础进行同源比对,经PCR扩增和生物信息学分析获得CsTPST基因序列信息、结构和亲缘关系,并利用qRT-PCR对其表达模式进行分析。【结果】CsTPST基因cDNA全长789 bp,编码262个氨基酸。进化分析结果表明,CsTPST蛋白与甜瓜的TPST蛋白亲缘关系最近,其氨基酸序列相似性为93%。 qRT-PCR分析结果表明,CsTPST基因在黄瓜雌花、根和叶片中表达量较高,在雄花和茎中表达量较低。此外,CsTPST基因在乙烯合成促进剂ACC处理的黄瓜叶片中上调表达,而在乙烯合成抑制剂AVG处理下呈下调表达。 CsTPST基因启动子能激活GFP基因的表达。【结论】CsTSPT基因是一个受乙烯诱导表达的基因,可供开展CsTPST基因的生物学功能及性别决定的分子机理研究参考。     

黄瓜细胞质型谷氨酰胺合成酶基因(GS1)的克隆及其在低氮条件下的表达

【目的】分离和克隆黄瓜谷氨酰胺合成酶GS1基因,分析其序列特征,了解其在低氮条件下的表达情况。【方法】依据黄瓜基因组数据库中Csa015274基因编码区全序列,应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计引物,从黄瓜叶片cDNA中克隆该基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析鉴定,并用实时荧光定量PCR法研究GS1基因在不同氮素浓度下的表达变化。【结果】分离到GS1基因,GenBank登录号为JQ277263。该基因长1 071 bp,编码356个氨基酸,与甜瓜(Cucumis melo L.)GS1基因同源性高达97%。该基因编码的蛋白是1个不稳定的疏水蛋白,无跨膜结构,无信号肽,存在蛋白激酶C磷酸化位点,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,N-十四酰化位点,酪氨酸激酶磷酸化位点等活性位点。GS1基因表达模式分析显示,在低氮条件下,该基因下调表达,随着氮素浓度的增高GS1基因的表达量增加。在高浓度的氮素水平下,该基因的表达同样受到抑制。【结论】成功从黄瓜叶片中分离克隆到GS1基因,该基因具有已知物种GS1基因的特征,可用于该基因的功能研究。     

多年生黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP的克隆及功能分析

【目的】研究黑麦草在逆境胁迫下水分代谢的基因调控,克隆黑麦草质膜型水通道蛋白基因的全长cDNA序列,并对其表达模式进行研究。【方法】利用RACE技术从黑麦草（品种“顶峰”）中获得LpAQP全长cDNA序列;运用生物信息学软件分析其编码蛋白;构建LpAQP与GFP融合的瞬时表达载体,采用基因枪法转入洋葱表皮细胞,观察其细胞定位;通过real time-PCR分析LpAQP的表达模式,并用Southern杂交分析其拷贝数。【结果】克隆获得LpAQP的cDNA序列,GenBank登录号为JX569791,其开放阅读框（ORF）为867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质分子量为30.7 kD。该基因含有2个NPA单元,6个跨膜区,LpAQP含有与MIP家族完全一致的蛋白质保守区,其氨基酸序列与其它禾本科PIP类质膜型水通道蛋白同源性较高。物种间聚类分析表明LpAQP与大麦、小麦质膜型水通道蛋白同源性较高。LpAQP可能定位于细胞质膜上。通过Southern杂交分析,发现LpAQP在黑麦草基因组中以单拷贝存在。real time-PCR分析表明LpAQP在黑麦草茎部表达高于叶和根,持续干旱胁迫会导致LpAQP表达量先上调后下降。【结论】克隆获得黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP,其以单拷贝形式存在,在黑麦草根、茎、叶中均有表达,尤其是茎中表达最高。其表达受干旱胁迫影响。     

家蚕生物钟基因Bmtim2的克隆与序列分析

[目的]为进一步研究家蚕生物钟基因的功能提供依据。[方法]从家蚕品种p50未受精卵提取总RNA,利用快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆家蚕生物钟基因Bmtim2cDNA序列。最后运用实时定量RT-PCR对该基因在家蚕不同发育时期的表达情况进行初步分析。[结果]利用RACE扩增,获得长度为1867bp、包括完整3'非翻译区的家蚕生物钟基因timeless2(Bmtim2)cDNA序列。经推导,获得该基因序列编码的584个氨基酸残基的蛋白质序列。该蛋白序列具有TIM蛋白的C末端保守区,与黑腹果蝇、尖音库蚊的TIM2基因具有近缘进化关系。Bmtim2基因在家蚕生活周期各时点均有表达。[结论]该结果对研究Bmtim2基因在家蚕发育过程的时空表达差异及其与日周节律的关系具有参考价值。     

陆地棉干旱胁迫响应基因GhGR的克隆及特征分析

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因（GhGR）,并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树（XP_002299276.1）、蓖麻（XP_002518118.1）、葡萄（CAN74593.1）同源性最高,分别为90%、91%和91%。系统发育树结果显示,GhGR与葡萄中该蛋白的亲缘关系最近。基因枪转化和实时荧光定量PCR分析表明GhGR定位于洋葱的细胞膜和细胞核膜,并且其表达量受干旱胁迫诱导上调表达。【结论】从陆地棉克隆得到谷胱甘肽还原酶基因GhGR,初步认为该基因对干旱胁迫有一定响应。     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

一个麻疯树AP2/ERF家族基因的克隆和植物表达载体的构建

[目的]克隆1个麻疯树AP2/EFR家族的基因,并构建其植物表达载体。[方法]利用麻疯树EST数据库中的AP2/ERF相关信息设计引物,通过RT-PCR克隆麻疯树AP2/EFR家族的基因,用生物信息学方法对其序列进行分析,并构建其植物表达载体。[结果]试验克隆到1个AP2/EFR家族基因JcERF;从cDNA序列、氨基酸序列、保守域序列、功能组成、理化性质、进化树等方面进行分析,结果显示JcERF属于AP2/EFR家族中的ERF亚家族;将JcERF连接至pCAMBIA1301载体上,构建了以35S为启动子的植物表达载体。[结论]该研究为麻疯树中JcERF的功能研究及提高麻疯树的抗逆性奠定了基础。     

芥蓝黑芥子酶基因的克隆与原核表达

根据GenBank上已公布的植物黑芥子酶基因序列设计引物,采用RT-PCR和3′/5′-RACE相结合的方法,从芥蓝中克隆出黑芥子酶基因全长cDNA序列.序列全长为1832 bp,开放阅读框为1647 bp,编码549个氨基酸,含有糖基水解酶家族Ⅰ(Glyco_hydro_1)活性位点,GenBank登录号为DQ767973.该核苷酸序列与十字花科其他植物的黑芥子酶基因序列具有较高的同源性,同油菜、萝卜、芥菜和大白菜的同源性达90%以上.利用pET28-α(+)构建芥蓝黑芥子酶基因的原核表达载体,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的分子质量约为65 ku.     

海岛棉GbHCT10基因的克隆与表达分析

[目的]研究海岛棉(Gossypium barbadense)GbHCT10基因在棉纤维发育中的作用.[方法]以海岛棉品种新海21号纤维发育第5 d的样本作为材料,根据海岛棉GbHCT10基因序列设计一对引物,利用RT-PCR技术从中克隆GbHCT10核苷酸序列.利用生物信息学方法分析GbHCT10基因序列.[结果]采...     

嗜酸乳杆菌S-层蛋白表面展示系统的构建及酶切位点分析

[目的]克隆和表达嗜酸乳杆菌S-层蛋白基因,用其构建能承载外源抗原表位的乳酸菌细胞表面展示系统。[方法]以染色体DNA为模板克隆S-层蛋白基因SlpA,通过酶切、连接将其插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pW425et,构建表面展示系统pW425et-S,并对酶切位点进行分析。[结果]将pW425et-S转化入thyA基因缺陷型E.coli X13感受态细胞,SDS-PAGE、Western-blotting、全细胞ELISA检测表明,在重组菌表面表达出S-层蛋白,构建出表面展示系统,确定BstEⅡ作为融合外源保护性抗原基因的酶切位点。[结论]克隆出嗜酸乳杆菌S-层蛋白基因,成功构建表面展示系统pW425et-S,为开发乳酸菌活载体口服活菌疫苗提供了可行性操作平台。