二花脸猪Smad4基因的克隆与卵巢组织mRNA的表达水平

[目的]了解二花脸猪Smad4(common-mediator Sma4)基因的序列特征和组织表达特征,分析二花脸猪与商品猪卵巢组织中Smad4基因mRNA表达水平的差异.[方法]采用克隆测序技术获得二花脸猪Smad4基因cDNA序列,利用生物信息学方法分析二花脸猪Smad4基因的序列特征和蛋白的理化性质、高级结构,RT-PCR检测其组织表达特征,并采用real-time PCR技术检测二花脸猪与商品猪卵巢组织中Smad4基因mRNA的表达水平.[结果]二花脸猪Smad4基因编码区序列全长1 659 bp,编码一个含有5 52个氨基酸残基的蛋白质,氨基酸序列与其它哺乳动物的同源性均在98％以上;二花脸猪Smad4也包括3个典型的结构域(MH1、SAD和MH2).二花脸猪Smad4基因在所检测的组织中均有表达,且卵巢组织中mRNA的表达水平极显著高于商品猪(P＜0.01).[结论]二花脸猪Smad4基因可能拥有其它哺乳动物Smad4基因相同的功能及其可能与猪高繁殖力间有一定相关.     

Smad7蛋白的研究进展

Smad 7是一种抑制蛋白,其主要功能是参与转化生长因子β(TGF-β)超家族的细胞内信号转导.介绍Smad 7蛋白的结构,参与的信号通路.对细胞的调节机制、     

牛Smad 9基因cDNA克隆及生物信息学分析

Smad 9属于R-Smads,在TGF-β信号传导过程中起着重要作用。本研究利用生物信息学方法,结合RT-PCR技术和SMARTRACE技术,得到全长为1 871 bp的牛Smad 9基因cDNA序列。通过核酸序列分析发现,牛Smad 9基因编码345个氨基酸残基,牛Smad 9蛋白无跨膜区和信号肽序列,该蛋白与人、小鼠、大鼠和红原鸡在氨基酸序列上分别有78.84%,79.21%,77.88%和70.38%的同源性。通过多组织RT-PCR分析发现,牛Smad 9基因的组织表达谱很广,在卵巢、肝、肌肉、小肠、脂肪、子宫、肾脏、心肌、肺、胰腺、睾丸、乳腺组织中均有表达。     

Smad7蛋白的研究进展

Smad7是一种抑制蛋白,其主要功能是参与转化生长因子β(TGF-β)超家族的细胞内信号转导。介绍Smad7蛋白的结构,参与的信号通路,对细胞的调节机制。     

草鱼 Smad4 基因的克隆、生物信息学分析及反义真核载体的构建

为了研究TGF-β信号传导中的关键蛋白Smad4在草鱼 Ctenopharyngodon idellus 发育过程中的作用,克隆出草鱼 Smad4 基因cDNA全序列,其碱基长度为2 974 bp,其中开放阅读框1 644 bp,编码547个氨基酸.生物信息学分析结果显示,草鱼Smad4蛋白相对分子质量为59 690.3,分子式为C_{2 632}H_{4 073}N₇₅₃O₇₉₁S₂₄,理论等电点为6.5,含有MH1和MH2这2个高度保守的功能结构域.BLAST相似性分析显示,草鱼Smad4蛋白的氨基酸序列与鲤 Cyprinus carpio、斑马鱼Danio rerio的相似性较高,分别为94.23%和92.97%.还将草鱼 Smad4 基因的开放阅读框片段反向插入表达载体pcDNA3.1(+),成功构建了反义 Smad4 基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-Anti-Smad4.     

PC12细胞诱导的神经缺血细胞Smad7-siRNA及沉默效果的检测

目的探讨诱导PC12细胞分化的神经细胞靶向沉默Smad7基因特性,同时进行沉默效果检测．方法以Smad7基因为靶目标,设计合成3条siRNA序列,进行细胞转染,利用Rea1time—PCR和Westernblot技术检测沉默效果,筛选出最有效的干扰序列,同时检测出最佳的转染浓度和转染时间．结果针对Smad7基因设计合成及筛选出靶向沉默Smad7基因的干扰序列（siRNA1）;siRNA1的最佳转染浓度是4μg／mL;siRNA1的最佳转染时间是24h;siRNA1对Smad7的抑制效果优于其他干扰序列．结论siRNA1能有效沉默Smad7基因;lipofecta—mineTM2000可成功将siRNA1转染至神经细胞,转染效率较高;利用siRNA技术能有效抑制神经细胞．     

Smad4在附植期绵羊子宫内膜的分布

为了检测转化生长因子β超家族蛋白共同的胞质内信号转导分子Smad4在绵羊胚胎附植期子宫内膜的分布,探索Smad4上游信号分子在绵羊胚胎附植过程的作用机制,于绵羊交配后12 dpc(12 day post coitus),16 dpc,20dpc,24 dpc,28 dpc,32 dpc解剖取材子宫组织与胚胎组织,应用免疫组织化学技术,研究了Smad4蛋白在子宫内膜的分布。结果显示,Smad4蛋白定位于子宫腺上皮和子宫腔面上皮细胞以及上皮下方的基质中。根据实验观察得出初步结论,Smad4表达于附植早期绵羊子宫内膜,子宫内膜组织有接受转化生长因子β超家族蛋白信号作用的能力,Smad4在介导胚胎附植到母体子宫内膜的过程中发挥作用。     

Smad家族成员2/3/4原核表达载体构建和融合蛋白纯化

目的 构建针对Smad家族相关系列原核表达载体,观察其相应蛋白诱导表达纯化情况.方法 PCR扩增Smad2/3/4全长及截短片段,定向插入pGEX-6P-1载体中,构建原核表达重组质粒pGEX-6P-1-Smad2/3/4.经酶切和测序正确后,重组质粒转化表达菌株BL21(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;上清经GST-Sepharose4B亲和纯化,SDS-PAGE考-马斯亮蓝染色鉴定.结果 原核表达载体pGEX-6P-1-Smad2/3/4构建成功,SDS-PAGE证实Smad3A和Smad4存在包涵体,而上清中GST-Smad3(B-D)和GST-Smad2可被纯化.结论 构建的融合蛋白原核表达载体通过诱导和纯化后得到GST-Smad3截断融合蛋白(B-D)和GST-Smad2.     

褪黑素对大鼠纤维化TGF-β1/Smads信号通路干预研究

褪黑素是一种主要由松果体分泌的多效性神经激素,具有多种生物学功能,包括抗氧化应激、抗炎、抗凋亡和抗肿瘤特性,以及调节昼夜节律。为探寻临床治疗肾间质纤维化的新途径,本试验观察褪黑素对单侧输尿管梗阻(UUO)构建大鼠肾纤维化模型TGF-β_1/Smads信号通路影响,探讨其干预对肾纤维化机制,SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、UUO模型(UUO)组、UUO+5mg·kg~(-1)褪黑素组、UUO+10mg·kg~(-1)褪黑素组、UUO+15mg·kg~(-1)褪黑素组,每组6只。均于手术当天晚上灌胃给药,每24h1次。14d处死大鼠,取血清检测血肌酐、尿素氮,肾组织进行Masson染色,观察病理结果,实时定量PCR检测肾组织TGF-β_1、Smad3、Smad7和Collagen Type I mRNA表达。结果表明:褪黑素减轻肾组织纤维化病理损伤,使肾组织TGF-β_1、Smad3、Collagen Type I mRNA表达降低,Smad7mRNA表达升高(P0.05,部分P0.01),以15mg·kg~(-1)改善效果最佳。褪黑素可呈剂量相关性下调TGF-β_1、Smad3、Collagen Type I及上调Smad7来抑制TGF-β_1/Smads信号通路,从而发挥肾间质纤维化作用。     

基于Smad 7基因为靶序列的RNA干涉作用研究

为了探讨小干涉RNA(siRNA)对靶基因Smad7mRNA表达的阻断作用,采用体外转录方法制备Smad7基因的小干涉RNAs(siRNAs),用脂质体介导瞬时转染BERP35T 2肺癌细胞系,并采用Northernblot杂交检测靶基因mRNA的表达丰度。结果表明,根据Smad7编码区序列在体外成功地制备了针对2个不同靶序列的siRNAs;Northernblot杂交显示,在转染siRNA的BERP35T 2细胞中,不管是内源性的还是外源性的,Smad7mRNA的表达丰度均明显下降。说明Smad7基因编码区中542563bp及701722bp2个区域均是siRNA作用的有效靶序列,本研究设计并制备的siRNAs能有效抑制Smad7基因的表达。     

Arkadia和UCH37表达载体的构建及其对TGF-β1/Smads信号通路的影响

【目的】构建泛素启动酶Arkadia和泛素羧基末端水解酶-5（亦称UCH37）的表达载体,并探讨Smad7蛋白的泛素化修饰对马兜铃酸肾病中TGF-β1/Smads信号通路的影响。【方法】通过观察绿色荧光的表达量及real-time PCR反应优化转染条件,转染Arkadia和UCH37 siRNA,real-time PCR检测mRNA表达抑制率。分别构建Arkadia和UCH37的表达载体pGPU6/GFP/Neo,经鉴定后转染细胞,real-time PCR和Western blotting检测Arkadia、UCH37和Smad7的表达变化。【结果】①30 pmol siRNA和1.5 μL LipofectamineTM 2000为最佳转染条件;②Arkadia-1490和UCH37-721的干扰效果最明显;③载体的插入序列完全正确,且pGPU6/GFP/Neo-Arkadia能上调马兜铃酸肾病模型中Smad7的表达,而pGPU6/GFP/Neo-UCH37使Smad7表达下降。【结论】成功构建了表达载体pGPU6/GFP/Neo-Arkadia和pGPU6/GFP/Neo-UCH37,且Arkadia和UCH37可分别放大、抑制TGF-β1/Smads信号通路。     

Smad9基因干扰表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及内分泌的影响

为阐明BMP/Smad信号通路下游的转录因子 Smad9对鹅卵泡发育的调控作用，研究采用RNAi技术干扰 Smad9基因在鹅卵泡颗粒细胞的表达。通过对SMAD9蛋白表达定位， Smad9基因干扰后颗粒细胞的增殖情况以及卵泡发育相关激素及其受体的表达分析，探讨 Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖及其内分泌功能的影响。结果显示，SMAD9蛋白在鹅卵泡仅表达于颗粒细胞，Smad9-siRNA显著抑制 Smad9的表达。 Smad9干扰后颗粒细胞的增殖能力明显降低，细胞上清中雌二醇（E₂）的水平显著下降，孕酮（P_{4）水平未见明显变化，细胞色素P450芳香化酶基因（ CYP19A1）和促黄体素受体（LHR）基因的表达显著下降，促卵泡素受体（FSHR）基因的表达无显著变化。这些结果表明，干扰 Smad9基因表达对鹅卵泡颗粒细胞增殖和内分泌功能均产生显著影响，其机制可能是 Smad9基因表达抑制后引起颗粒细胞E2合成减少和LHR的表达下降有关。}     

Screening and degradation characteristics of a tylosin-degrading strain

Antibiotics residues have been accumulating in the environment day by day due to overuse of antibiotics. Recalcitrant antibiotic residues, such as tylosin(TYL), can cause serious environmental problems, which makes it important to eliminate TYL from the environment. It is important to eliminate TYL from the environment. In this study, a strain was isolated and purified from fermentation by-product that came from a TYL production factory. The TYL degrading strain was identified by its morphology, physiological and biochemical reactions and sequencing the PCR-amplified fragments of its 16 S r DNAcoding genes. The temperature, shaking speed, initial TYL concentration, p H and inoculum sizes were investigated under simulated conditions by using single factor tests. The results showed that TYL2, a high efficient strain was isolated and was identified as Brevibacillus borstelensis. The degradation rate of TYL by this strain could reach to 75% with an initial concentration of 25 mg L~(–1) within 7 days under conditions of 7% B. borstelensis(v/v, 2×108 CFU m L~(–1)) at p H 7.0 and at 35°C. It is interesting that this strain has a very strong ability to degrade the TYL in natural sewage with the degradation rate of 65% within 7 days. This result could be helpful for the degradation of TYL and provide guidance for the degradation of other antibiotics.     

牦牛bta-miR-1434-5p和Smad1基因组织表达谱及荧光素酶报告载体构建

为探索牦牛Smad1基因与bta-miR-1434-5p是否存在靶向关系,探究bta-miR-1434-5p分子调控可能机制,利用RT-PCR技术对bta-miR-1434-5p和Smad1 mRNA在牦牛组织中的表达谱进行检测,并构建pmiR-RBREPORTTM双荧光素酶报告载体对牦牛Smad1基因3′端非翻译区(3′UTR)与bta-miR-1434-5p的靶向关系进行研究。结果表明:Smad1基因mRNA在牦牛下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、淋巴结、卵巢、输卵管、子宫组织中均有广泛表达;bta-miR-1434-5p除在牦牛输卵管中没有表达外,在其他组织均与Smad1基因mRNA共表达;获得牦牛Smad1基因3′UTR序列并成功构建野生型及突变型pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告质粒;荧光素酶活性检测发现bta-miR-1434-5p mimics对Smad1野生型质粒报告荧光没有明显的下调作用,由此推测btamiR-1434-5p与牦牛Smad1基因的该段3′UTR之间未发现明显互作。     

一个葡萄抗逆相关转录因子VvPF1基因的in silico克隆及生物信息学分析

AP2/EREBP是植物所特有的一类转录因子,广泛参与植物生长、发育以及多种生理生化反应的信号传导.本文利用in silico克隆方法获得葡萄VvPF1 基因,并利用生物信息学方法对该基因编码产物从氨基酸组成、理化性质、进化关系、二级及三级结构、功能等方面进行预测和分析.结果表明:VvPF1 是一个含有明显AP2结构域,具有潜在核定位能力的ERF类转录因子.此外,VvPF1与CaPF1, JERF1等抗逆相关的转录因子具有较高的同源性,因此推测,VvPF1很可能参与葡萄对生物和非生物胁迫的信号传导.