TK酶基因在乳酸乳球菌中的表达

利用乳酸乳球菌nisin诱导基因表达系统(the Nisin Controlled gene Expression system,NICE)表达TK酶基因.采用基因克隆和表达方法,表达产物通过SDS-PAGE进行鉴定.重组质粒测序结果表明,转化到乳酸乳球菌中的TK基因与pWSTK6基因(登录号为EU530625.1)相...     

猪链球菌噬菌体SMP末端酶大亚基单位的活性研究

末端酶(terminase)是dsDNA病毒包装过程中的必要功能蛋白,其大亚基单位在包装过程中往往行使全酶的作用,一般具有ATP酶活性和限制性内切酶活性。噬菌体SMP是猪链球菌2型的烈性噬菌体,本研究以SMP基因组为模板,扩增SMP末端酶大亚基单位基因(TlsSMP),构建pEASY-E1-Tls重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达,并对TlsSMP融合蛋白进行活性检测。结果显示,末端酶大亚基单位在大肠杆菌中呈可溶性表达,具有ATP酶生物学活性,在pH7、23℃和Mg2+存在的条件下,其活性最强,其他金属离子如Ca2+、Mn2+和Co2+都对其有不同程度的抑制作用。本研究为进一步研究猪链球菌噬菌体的包装机制奠定基础。     

一种大肠杆菌噬菌体新裂解酶的表达与活性检测

前期分离得到1株具有较强裂解能力的大肠杆菌噬菌体v B_Eco M-ep3。测序后发现,噬菌体v B_Eco M-ep3的裂解酶基因在大肠杆菌噬菌体中尚未报道,能够编码一种新的裂解酶,并与绿脓杆菌噬菌体裂解酶具有很高同源性。为了探讨该裂解酶对大肠杆菌和绿脓杆菌的裂解活性,克隆了v B_Eco M-ep3的裂解酶基因,经原核表达和纯化,体外评价了Lysep3裂解活性。结果表明:克隆裂解酶基因Lysep3长为492 bp;表达蛋白分子质量为17.7 ku;裂解酶单独作用时,对大肠杆菌和绿脓杆菌均不能裂解,但是能够显著抑制生长;与柠檬酸配合使用(0.5 mg/m L终浓度的Lysep3和0.5 mmol/L终浓度的柠檬酸),对大肠杆菌和绿脓杆菌均表现出较好的裂解能力,作用从2~24 h持续有效,细菌数量分别下降7.2倍和17.3倍。该结果表明,v B_Eco Mep3的裂解酶不但在基因序列上与绿脓杆菌存在进化关系,在功能上也具有相关性。该研究为解析裂解酶结构与功能的关系提供了一个良好的例证,同时有助于裂解酶的广谱性改造。     

噬菌体裂解酶的应用概况

近年来由于耐药菌的频频出现,抗生素在抗感染领域面临前所未有的挑战,目前研制可裂解病原菌的噬菌体制剂已为一大热点。噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体在基因组复制晚期合成的一类蛋白质,它能够水解细菌细胞壁中的肽聚糖从而杀灭细菌。噬菌体裂解酶在体内外的试验中都表现出很高的杀菌性、种属特异性和安全性,因而具有广阔的应用前景。简要介绍了噬菌体裂解酶的结构性质,并对裂解酶显示出的抗菌性能及应用进行了综述。     

大肠杆菌O157 Stx噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析

为研究大肠杆菌O157Stx噬菌体编码的裂解酶(内溶素)对肠出血性大肠杆菌的抗菌作用,克隆表达了大肠杆菌O157Stx噬菌体裂解酶,并检测其裂解作用和裂菌谱。利用PCR方法扩增大肠杆菌O157Min27株中Stx2噬菌体裂解酶基因(R基因),构建表达质粒pET28a(+)-lysEC1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。重组质粒在BL21中获得了高表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的34%,经His-trapTM亲和层析柱纯化后,获得的重组LysEC1的纯度大于97%。体外裂解活性试验证实纯化的噬菌体裂解酶LysEC1对肠出血性大肠杆菌菌株具有很好的裂解作用,这为新型噬菌体抗菌生物制剂的研发提供了新的研发方向。     

乳酸乳球菌的质粒消除

质粒消除是鉴定质粒和获得无质粒菌株的重要方法,是乳酸菌进行遗传学改造所需的一项重要技术。试验采用高温和消除剂结合的方法,对乳酸乳球菌镉抗性菌株进行质粒消除,探讨温度、消除剂吖啶橙的用量和作用时间对乳酸乳球菌镉抗性质粒消除的影响。结果表明,39℃高温可以质粒消除,而37和41℃均无此效果;独自吖叮橙作用未获得质粒消除菌株;39℃高温-吖啶橙同时作用比高温-吖啶橙交替作用消除率高,而39℃高温-20μg·mL-1吖啶橙共同作用12d,消除率可达98%。根据消除结果,以疑似功能性质粒为模板,进行PCR扩增,获得预期片段,进一步证实了其功能。     

乳酸乳球菌抗氧化的研究进展

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)主要是通过发酵产能的,但是有研究发现,在添加氯化高铁血红素后乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)能形成一条呼吸链,在乳酸乳球菌(L.lactis)IL1403中发现了能够编码呼吸链蛋白的基因,同样的现象在粪链球菌中(Strepto coccus feacalis)也有发现。当氧出现在电子传递链中,质子的排出和质子运动势(PMF)的产生都会加倍。相比较其他的兼性或者专性厌氧菌,乳酸乳球菌(L.lactis)的呼吸作用可以促进代谢能量的产生,由于这种呼吸作用,乳酸乳球菌(L.lactis)有更好的生长得率和显著的存活率,这表明在发酵条件下产生的代谢能量不足,从而会限制乳酸乳球菌(L.lactis)的生长。氧在呼吸链中扮演了重要的有益角色,而不是起毒害作用。     

乳酸乳球菌抗氧化的研究进展

乳酸菌（Lactic acid bacteria,IAB）主要是通过发酵产能的,但是有研究发现,在添加氯化高铁血红素后乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）能形成一条呼吸链,在乳酸乳球菌（L．lactis）IL1403中发现了能够编码呼吸链蛋白的基因,同样的现象在粪链球菌中（Strepto coccus feacalis）也有发现。当氧出现在电子传递链中,质子的排出和质子运动势（PMF）的产生都会加倍。相比较其他的兼性或者专性厌氧菌,乳酸乳球菌（L．lactis）的呼吸作用可以促进代谢能量的产生,由于这种呼吸作用,乳酸乳球菌（L．lactis）有更好的生长得率和显著的存活率,这表明在发酵条件下产生的代谢能量不足,从而会限制乳酸乳球菌（L.lactis）的生长。氧在呼吸链中扮演了重要的有益角色,而不是起毒害作用。     

气相色谱法测定乳酸乳球菌脂肪酸

为了建立气相色谱法分析乳酸乳球菌脂肪酸方法,试验参照不同文献所提供的甲酯化方法对乳酸乳球菌进行甲酯化处理,通过对其气相色谱图中相同峰的峰面积进行比较,对比各个甲酯化方法的的效果。并对乳酸乳球菌MG1363进行气相色谱分析。结果表明,在对几种甲酯化方法进行比较后,发现酸碱结合法甲酯化法不适合乳酸菌,而三氟化硼甲酯化法明显优于酸催化与碱催化甲酯化法。并且测定出乳酸乳球菌MG1363的主要脂肪酸种类。结果表明,三氟化硼催化甲酯化法最适于乳酸乳球菌脂肪酸。乳酸乳球菌MG1363中除含有14和16C等脂肪酸外,还含有一种19C的环丙烷脂肪酸。     

沙门氏菌噬菌体裂解酶LysLorf22的制备及溶菌活性分析

根据沙门氏菌噬菌体Lumpael的全基因组序列,预测该噬菌体裂解酶基因并对其进行生物信息学分析;优化其在大肠杆菌表达系统中的表达,并分析噬菌体裂解酶LysLorf22与外膜渗透剂最优组合的溶菌效果。结果表明,裂解酶LysLorf22的相对分子质量为1.76×10~4,等电点为9.14,其较优表达条件为:表达菌株Escherichia coli BL21,37℃诱导4 h。LysLorf22裂解谱较宽,最佳工作浓度为375 nmol/L,在30 min内可使氯仿处理的Salmonella Enteritidis ATCC 13076菌悬液OD_(600)下降0.72;375 nmol/L的LysLorf22与0.5 mmol/L乙二胺四乙酸二钠联用对Salmonella Enteritidis ATCC 13076溶菌效果最佳,在2 h内可使活菌数从1.62×10~9 CFU/ml下降至4.31×10~8 CFU/ml。     

乳酸乳球工程菌表达L-苯丙氨酸解氨酶的工艺优化

[目的]提高乳酸乳球工程菌表达L-苯丙氨酸解氨酶的水平.[方法]对培养基种类、接种量、培养温度、诱导剂浓度、磷酸甘油二钠浓度等因素进行了优化.[结果]使用DifcoTM M17 Broth培养基培养乳酸乳球菌时,L-苯丙氨酸解氨酶表达活性最高;磷酸甘油二钠对L-苯丙氨酸解氨酶表达活性有较大影响,可提高活性93.8％.通过正交试验,得到PAL最佳表达条件为接种量2.0％,培养温度30℃,磷酸甘油二钠浓度2.0％,诱导剂浓度10.0 μg/L. PAL表达酶活可达3.05 IU/ml.[结论]在发酵扩大培养中优化了L-苯丙氨酸解氨酶在乳酸乳球菌中的表达条件,为今后生产及应用提供参考.     

乳链菌肽抗性菌株的定向筛选及鉴定

利用乳链菌肽抗性菌株中乳链菌肽抗性和乳糖发酵紧密连锁的原因，在含有乳链菌肽、乳糖和溴甲酚紫的选择培养基上，从205个新鲜的牛奶样品中定向筛选乳链菌肽抗性菌株。对筛选到的4株菌分析鉴定结果表明：4株菌均为革兰氏阳性菌，产乳酸，过氧化氢酶试验阴性；通过质粒的抽提和电泳，发现Lactococcus Lactis subsp.lactis ZL2009,ZL2009,ZL2010,ZL2024,ZL2030分别含有1，7，5，3条质粒带，且4株菌的质粒DAN分子大小不完全相同。     

重组乳酸乳球菌的异常毒性评价

[目的]评价重组乳酸乳球菌的异常毒性,为其制备黏膜免疫活载体疫苗及免疫型微生态制剂提供理论支持。[方法]给小白鼠腹腔注射不同剂量的表达金黄色葡萄球菌纤黏蛋白原凝集素A(ClfA)的重组乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clf A菌液,评价重组乳酸乳球菌的异常毒性。[结果]注射高、中、低剂量重组乳酸乳球菌液的各组小白鼠7 d内无一死亡,体重增长正常。[结论]重组乳酸乳球菌对机体未见异常毒性,适合制备黏膜免疫基因工程活载体疫苗和免疫型微生态制剂。     

乳酸链球菌最适抑菌培养条件的研究

为降低天然防腐剂乳酸链球菌素（Nisin）的生产成本,以金黄色葡萄球菌为试验菌,探讨了直接利用乳酸链球菌（Lactococcus lactis）培养液进行抑菌的最适培养条件。首先通过单因素试验,初步确定了最适碳源、氮源、金属离子及其浓度或配比的范围,然后采用正交试验L9（3^3）优化后得到的乳酸链球菌抑茵的最佳发酵条件为：3.0g／100g葡萄糖,4g／100g蛋白胨,2g／100g酵母膏,1g／100g牛肉膏,0.005mol／L MgSO4。优化后的培养基抑菌能力明显提高,此结果可为乳酸链球菌素的生产提供参考。     

乳酸乳球菌质粒提取方法的改进与优化

[目的]建立一种简便、快速、安全的乳酸乳球菌质粒提取方法.[方法]质粒提取采用文献报道的乳酸菌质粒提取与常用的大肠杆菌质粒提取相结合的方法,并对提取过程中溶菌酶浓度、溶菌酶处理方式和时间进行优化.[结果]采用改良后的方法提取乳酸菌质粒效果显著.最佳溶菌酶浓度是10 mg/mL,最佳溶菌酶处理方式和时间是37℃振荡培养30 min.[结论]该方法避免了毒性物质溴化乙锭的使用,同时减少了通常提取乳酸菌质粒的复杂步骤,是一种高效、快速、安全的提取乳酸菌质粒的方法.     

乳酸乳球菌NICE系统食品级分泌表达载体pRNV48的构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达

乳酸菌NICE系统是目前较理想的可控制蛋白质生产的食品级诱导表达系统,而乳酸菌分泌表达异源蛋白比细胞质表达更优越。本研究将以pVE5524为模板PCR扩增的1.5 kbSPUsp45-NucA-CWAM6-t1t2基因克隆到食品级细胞内诱导表达载体pRNA48上,构建成食品级细胞壁锚定表达载体pRNV48,与宿主菌L.lactisNZ9000共同构成乳酸乳球菌食品级细胞壁锚定诱导表达系统。为检测该系统的功能,将铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H克隆进pRNV48中,并检测了OprF/H的表达量和免疫原性。