应用SRAP标记鉴定甜瓜种子纯度

以甜瓜的3份代表性种质资源为供试亲本,制定2个杂交组合,用SRAP( sequence related amplified polymorphism)标记对2种甜瓜杂交种子纯度进行鉴定与分析,筛选出适合该杂交种纯度鉴定的多态性SRAP引物,从而为甜瓜的分子标记辅助育种研究奠定基础.结果显示:在42个引物组合对2个杂交品种的亲本筛选中,共有37对引物组合具有多态性,多态性引物组合达到88.1％.杂交组合皇后×安农(A)和杂交组合K-413×安农(B)的种子纯度分别为94.19％和94.05％.     

利用SRAP引物组合构建甜菜品种的指纹图谱

为了构建甜菜品种的指纹图谱,通过对183对SRAP引物组合的筛选,筛选出多态性好、条带清晰易于识别的SRAP引物组合两对(EM4-ME8和EM7-ME10)。利用筛选出的两对引物组合构建17份已经登记品种的指纹图谱,结果表明,引物组合EM7-ME10可以鉴别15个品种,扩增产生15种不同的带型；引物组合EM4-ME8可以鉴别14个品种,扩增产生14种不同的带型；这两对引物组合结合到一起就可以鉴别全部的17个品种。利用SRAP引物组合构建甜菜品种指纹图谱的成功为快速鉴定甜菜品种的真实性提供了一个新的解决办法,也为保护农民和育种家的权益提供了一个新的思路。     

芦笋SRAP反应体系优化及引物筛选

本研究以芦笋基因组总DNA为模板,通过对芦笋SRAP反应体系的重要参数进行优化,建立了一套适用于芦笋的SRAP反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量80ng、Mg2+浓度3.0mmol/L、上下游引物各0.2μmol/L、dNTPs0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶1U以及1×Buffer。扩增程序为:94℃预变性3min;94℃30s、35℃30s、72℃1.5min,5个循环;然后退火温度提高到50℃,35个循环;最后72℃延伸10min。比较琼脂糖凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SRAP扩增产物的多态性,结果发现:6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物比琼脂糖的效果好。利用该优化体系筛选引物,从256个SRAP引物组合中筛选出239个,它们具有扩增条带清晰、丰富、重复性好的优点,证明了此优化体系稳定可靠。     

直接扩增甜瓜小卫星DNA指纹图谱

以小卫星DNA YNZ22核心序列为引物,甜瓜DNA为模板,在甜瓜上研究了直接扩增小卫星DNA(DAMD)的优化反应体系,结果表明:在20μL的反应体系中,5种主要成分Taq DNA聚合酶、Mg2 、引物、模板DNA和dNTPs的最适浓度分别为1U,2.5 mmol/L,0.5 mmol/L,30 ng,5 mmol/L。在优化的DAMD-PCR反应体系下,利用该引物在28个甜瓜品种上构建了直接扩增小卫星DNA(DAMD)的指纹图谱,分析结果表明,该引物在28个甜瓜品种上共扩增出13位点,其中9位点具有多态性,多态性条带比率为69%,可一次性从28个甜瓜品种中鉴别出其中的21个,鉴别率高达75%。     

适合甜菜品种鉴定的SRAP核心引物的筛选

为筛选适合甜菜品种纯度鉴定的SRAP核心引物,以12个进口国外甜菜品种为材料,对546对SRAP引物组合进行扩增,利用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,选择适合甜菜品种纯度鉴定的SRAP核心引物组合。结果从546对SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富、重复性好的引物组合23对,这23对引物组合共扩增出177条多态性条带,引物的PIC值均大于0.6。平均每对引物扩增7.7条多态性条带,从理论上讲,这些核心引物完全可以实现对现有甜菜品种的鉴定。     

厚皮甜瓜品种组合SSR指纹图谱构建

采用SSR(Simple sequence repeat )标记技术对21份厚皮甜瓜品种(Cucumis melo ssp. melo) 组合进行分析,初步建立其DNA指纹图谱,为厚皮甜瓜品种DUS测试和品种鉴定奠定基础。从700对SSR引物中筛选23对多态引物组合,对所有供试材料进行分析,共检测出63条多态性条带,平均每个引物多态性条带为2.74条;多态信息含量（PIC）在0.52～0.69,平均0.61。应用其中6对引物组合（CMGAN12、MU7161、F22_85、F21_16、ECM79和MU5499）获得了每个品种组合的SSR特征带,可以将所有供试材料区分,初步建立21份厚皮甜瓜品种组合的SSR指纹图谱,为品种的真伪鉴定和知识产权保护提供有效的科学依据。     

正交设计优化青蒿SRAP-PCR反应体系及引物筛选

为了建立青蒿的SRAP最佳扩增体系,并筛选出SRAP多态性引物,本研究以青蒿叶片DNA为模板,采用正交试验设计,以Mg^2+、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板5种因素5个水平,对青蒿SRAP反应体系进行研究。结果表明,青蒿SRAP-PCR最佳反应体系为:引物0.6μmol/L、Mg^2+2.0 mmol/L、模板DNA 5.1 ng、Taq DNA聚合酶2.0 U、dNTPs 0.25 mmol/L,总体积为25μL。各因素对扩增反应均有不同影响,其中引物浓度的影响最大,dNTPs的影响最小。运用该体系对不同种质资源的青蒿进行验证,证明该体系稳定可靠,并在30个引物组合中筛选出了25对扩增条带清晰,多态性丰富的引物组合。这一结论为今后利用SRAP标记技术进行青蒿分子遗传学研究提供了科学依据。     

光萼荷属植物SRAP-PCR反应体系建立与引物筛选

为了建立光萼荷属植物(Aechmea) SRAP-PCR反应体系,为今后光萼荷属植物种质资源研究提供技术支持,本研究通过L16(45)正交试验设计,对光萼荷属植物SRAP反应体系中的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA浓度等5个因素进行优化实验,并筛选多态性SRAP引物组合。结果表明,光萼荷属植物的最佳SRAP反应体系为1.50 mmol/L Mg2+、400 μmol/L dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、15 μmol/L引物、30 ng模板DNA及1×PCR buffer。各因素对SRAP-PCR扩增反应结果影响的差异较大,依次为模板DNA>Taq DNA聚合酶>dNTPs>引物>Mg2+。从56对SRAP引物组合中筛选出51对扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物组合,多态性引物比率达90%以上。通过不同光萼荷属植物和不同引物组合对该反应体系进行验证,均获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明本研究建立的光萼荷属植物SRAP-PCR反应体系稳定可靠。     

甜瓜作图亲本相关序列扩增的多态性分析

以中国甜瓜地方品种自交系4G21(香瓜)和3A832(哈密瓜)为作图亲本,利用SRAP(Se-quence-relatedAmplifiedPolymorphism)分析了甜瓜作图亲本的多态性,结果表明:在184个SRAP引物组合中有176个扩增出多态性条带,不同引物组合扩增的多态性条带的变异幅度在1～15之间,共扩增出614个,平均每个引物组合扩增出3.34个,说明SRAP标记揭示甜瓜作图亲本多态性的效率很高。     

鉴定甜玉米品种真伪及种子纯度的RAPD引物筛选

采用CTAB法从6个甜玉米品种"正甜613"、"正甜38"、"粤甜3号"、"粤甜9号"、"粤甜13号"及"粤甜10号"的发芽胚轴提取DNA,用120个RAPD引物对其进行扩增比较分析,从中筛选到2个引物;SPS-A04和SPS-E20,在6个品种中扩增出相互不同的谱带,因此可用这两个引物构建DNA指纹图谱区分这些品种,或鉴定品种的真伪性。另外,对其中4个品种及其亲本进行了RAPD分析,筛选到3个引物,其中引物SPS-E15可同时用于"正甜613"、"正甜38"及"粤甜13号"3个品种的种子纯度检测,SPS-F06和SPS-F19则分别可用于"正甜38"和"粤甜10号"的种子纯度鉴定。     

温州盘菜地方品种鉴定与指纹图谱的分子标记分析

利用基因组DNA的RAPD、ISSR与SRAP等3种分子标记技术,以日本芜菁品种作为外类群,对来自于温州不同地区具有代表性的10个盘菜品种进行品种鉴定与遗传多样性分析。10个RAPD引物共产生多态性条带70条,多态率为71．7％;12个ISSR引物共产生142条清晰带,其中多态性条带70条,多态率为49．3％;8个SRAP引物组合共产生105条谱带,其中多态性谱带78条,多态性比率为74．3％,表明品种间存在较高的多态性。用单个引物NAURP299、NAUISR43以及SRAP引物组合mel／em2,都可以将11个品种完全区分开来。基于3种标记的聚类分析结果表明,11个材料可以分为3大类,一定程度上能够揭示品种之间园艺学性状的相似性及亲缘关系远近。     

主要樱桃番茄品种的分子鉴别

采用RAPD、RGA和SRAP分子标记技术对10个主要樱桃番茄品种进行了分子鉴别的研究。14个RAPD随机引物扩增后共产生了29个多态性位点;1对RGA引物产生了10个多态性位点;1对SRAP引物产生了5个多态性位点。分析单引物的品种鉴别能力发现,RGA和SRAP标记具有较高的鉴别效率。通过双引物组合分析发现,利用RAPD引物S311和RGA引物组PK1＋PK2可以将10个樱桃番茄品种区分开来,获得了各品种独特的核酸指纹。另外,在标记位点较多的情况下聚类结果基本上可以反映各品种之间生物学性状的相似性及亲缘关系的远近,但当标记位点数过少情况下,在一定程度上将使聚类结果失去本意。     

主要番茄品种的分子鉴别

采用了RAPD、RGA和SRAP分子标记技术对22个番茄品种进行了分子鉴别的研究。通过引物筛选,选用了7个RAPD随机引物,扩增后共产生了17个多态性位点;2对RGA引物,产生了12个多态性位点;1对SRAP引物,产生了8个多态性位点。分析单引物的品种鉴别能力发现,RGA和SRAP标记具有较高的鉴别效率。为了鉴别22个番茄品种,分析了双引物组合和三引物组合的鉴别能力,双引物组合不能完全区分22个番茄品种,利用引物BI26和PK1+PK2再加上S91或S92中的任一个就可将22个番茄品种区分开来, 并获得各品种独特的核酸指纹。另外,通过聚类分析发现,现代番茄品种之间存在着较为复杂的亲缘关系,用有限的标记位点很难取得理想的聚类结果。     

主要番茄品种的分子鉴别研究

采用了RAPD、RGA和SRAP分子标记技术对22个番茄品种进行了分子鉴别的研究。通过引物筛选,选用了7个RAPD随机引物,扩增后共产生了17个多态性位点;2对RGA引物,产生了12个多态性位点;1对SRAP引物,产生了8个多态性位点。分析单引物的品种鉴别能力发现,RGA和SRAP标记具有较高的鉴别效率。为了鉴别22个番茄品种,分析了双引物组合和三引物组合的鉴别能力,双引物组合不能完全区分22个番茄品种,利用引物BI26和PK1 PK2再加上S91或S92中的任一个就可将22个番茄品种区分开来,并获得各品种独特的核酸指纹。另外,通过聚类分析发现,现代番茄品种之间存在着较为复杂的亲缘关系,用有限的标记位点很难取得理想的聚类结果。     

利用SRAP与SSR标记分析不同类型甜菜的遗传多样性

为选育优质甜菜新品种, 指导种质资源引进和利用, 为进行分子标记辅助选择育种提供科学依据, 采用SRAP和SSR两种分子标记方法相结合, 对甜菜单胚雄性不育系及保持系等49份材料进行遗传多样性分析。利用4个表型差异显著的甜菜品系对SRAP的64对引物组合及SSR的11对引物组合进行扩增, 分别筛选出有效引物组合11对和9对。SRAP的11对引物组合共产生199条扩增带, 其中有86条多态性带, 多态性带的比率平均为43.7%。SSR的9对引物共产生35条扩增带, 多态性比率为100%。全部材料的平均遗传距离为0.3860, 平均遗传相似系数为0.6795, 大约30%的材料遗传距离或遗传相似系数具显著或极显著差异。遗传相似系数平均值比较, 多胚四倍体品系0.7264＞单胚杂交组合0.7243＞国外品种0.7060＞多胚二倍体品系0.6908＞单胚品系0.6837。在遗传距离0.20处, 将49个甜菜材料划分为A、B、C、D 4个类群, D类群又分为4个亚类, 较好地显示了甜菜材料丰富的遗传多样性。表明不同甜菜品种具有相当高的异质性, 国外与国内材料的遗传基础存在一定差异, 但生产应用的甜菜品种间存在亲缘关系较近、遗传基础较窄的倾向。     

Effective pairwise combination of long primers for RAPD analyses in roses

Twenty-four primers of different lengths (eight each of 10, 15 and 20 bp) were tested each in RAPD reactions with DNA of Rosa multiflora and Rosa canina. The reactions with single primers of a particular length were compared with all 28 pairwise combinations within each length class in both single primer reactions and in primer combination reactions. All primer classes produced fragment patterns of comparable complexity. However, the number of new fragment patterns and the number of fragments containing repetitive DNA was dependent on the primer length. Combinations of long 15- and 20-mer primers produced more new fragments and a lower amount of repetitive DNA than shorter 10-mer primers. Implications for the use of long primer combinations in projects which require large marker numbers are discussed in comparison with other marker systems.