改良大豆子叶节再生体系的研究

采用大豆种子萌发5~6 d后的子叶节作外植体，对农杆菌介导的大豆遗传转化系统及其影响因素进行了研究。结果表明，将子叶节与农杆菌共培养60 h后放入含卡那霉素50 mg/L的诱芽培养基上，待苗长至4~5 cm后放入生根培养基中进行生根，最后移栽到培养土中，效果较好。对大豆遗传转化再生的主要因素，如大豆基因型、诱导出芽所需激素浓度、卡那霉素筛选压力等条件做了一系列的研究，建立了一个比较好的遗传转化系统，其转化率达到2.8%。     

大豆子叶节再生体系的建立

以吉农28、吉农27、吉农17三个基因型大豆子叶节作为外植体,采用正交实验设计方法,对大豆的基因型和子叶节再生中植物生长调节剂浓度进行了研究。结果表明:适合大豆子叶节不定芽诱导的基因型是吉农27,最佳诱导培养基是MS+6-BA3.Omg/L+IBA0mg/L+2,4-D0mg/L。适合大豆子叶节不定芽继代的基因型是吉农17,最佳继代培养基是MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L。适合大豆子叶节不定芽增殖的最佳基因型是吉农27,最佳增殖培养基是MS+6-BA1.Omg/L+NAA0.1mg/L+GA31.Omg/L。     

高频率生菜植株再生及转化体系的建立

通过对两种生菜及其不同外植体在培养基上不定芽发生能力的筛选，得到“大湖３６６”叶切片不定芽发生率高达８７％的培养体系，并且丛生状不定芽可陆续发生。将叶切片与农杆菌共培养，对经ｋｍ筛选后所得再生株进行Ｘ－Ｇｌｕ染色，兰色反应阳性率为５０％。     

水稻植株再生与农杆菌介导的遗传转化研究

本研究以不同籼稻品种的成熟胚为材料，研究了不同培养基对愈伤组织诱导、分化和植株再生的影响，并研究了利用农杆菌介导bar基因和ipt基因的遗传转化技术。结果表明，采用NBD(N6salts B5Vitamin casamino acids 500mg／L proline 500mg／L glutamine 300mg／L mannitol 36．4g／L sucrose 30g／L 2，4-D 2mg／L 6-BA 0．2mg／L phytagel 2．5g／L，pH 5．8)为诱导培养基，MSD(MS casamino acids 500mg／L proline 500mg／L glutamine 300mg／L mannitol 36．4g／L sucrose 30g/L 2，4-D 2mg／L 6-BA 0．2mg／L phytagel 2．5g／L，pH 5．8)与NBD培养基交替继代培养，籼稻愈伤组织诱导率高、质量较好；采用MSR3^e(MS casamino acids 500mg／L glutamine 300mg／L proline 500mg／L mannitol 36．4g／L maltose 30g／L TDZ 0．2mg／L phytagel 5g／L pH 5．8)为分化培养基，愈伤组织分化率均在90％以上。本研究利用农杆菌介导，将Act启动子驱动的抗除草剂基因(bar)和异戊烯基转移酶基因(ipt)构建的融合基因表达载体对水稻进行遗传转化。初步确定了愈伤组织筛选及分化培养基附加除草剂(glufosinate ammoniun)4mg／L、头孢霉素300mg／L，愈伤组织预培养2-3天，共培养基中加入乙酰丁香酮浓度为39mg／L，共培养2-3天。通过上述培养条件，已获得移栽成活的水稻转基因植株。     

农杆菌介导大豆子叶节遗传转化的研究

直接以农杆菌转化系统为平台,以栽培大豆(Glycine max L.) 吉林35、中黄28、南农、铁丰29、铁丰30、开育12的子叶节为外植体,用LBA4404 农杆菌（含pPC-KSA质粒）研究了影响大豆子叶节转化的因素。结果表明,大豆品种之间转化存在着差异,吉林35转化率最高,平均转化率为2.16%,单次最高转化率达6.12%;中黄28次之,平均转化     

小豆子叶节遗传转化体系建立

以小豆品种‘京农6号’子叶节为外植体进行离体再生,旨在建立‘京农6号’子叶节再生遗传转化体系。本研究对农杆菌菌株EHA105侵染子叶节的时间、诱导愈伤生成的适宜6-BA浓度、诱导不定芽的激素浓度及配比及诱导不定根生长的IBA浓度等影响子叶节再生遗传转化体系的因素,结果发现农杆菌EHA105侵染的最佳时间为50 min,GUS阳性率为67.5%;诱导愈伤的适宜6-BA浓度为2.0 mg/L,诱导率为91.4%;诱导不定芽的最适激素是5.0 mg/L ZT,出芽率为62.0%;而0.1 mg/L IBA诱导不定根的效果最好,生根率可达100.0%。本研究建立了小豆‘京农6号’子叶节外植体的遗传转化体系,获得了再生植株,为小豆的CRISPR/Cas9基因编辑技术在小豆功能基因组学和育种中的应用提供了技术参考。     

甘蓝型油菜带节子叶再生体系的建立及遗传转化应用

优良再生体系的建立是农杆菌介导植物遗传转化的基础。本研究建立以甘蓝型油菜含部分子叶节的子叶为外植体的再生体系,该再生体系为:切取5日苗龄甘蓝型油菜含部分子叶节的带柄子叶为外植体,置于添加3 mg/L6-BA的MS基本培养基中培养5天,外植体再生出丛生不定芽,不定芽再生率为100%。基于新建立的带节子叶再生体系,通过农杆菌介导,成功地将用p FGC5941载体构建的Bn TFL1基因干扰载体转入甘蓝型油菜中,从播种到得到生根抗性苗,整个转化周期只需要60~70天,较传统甘蓝型油菜以不带节子叶为外植体100~130天的转化周期大大缩短。     

用根癌农杆菌介导法转化大豆萌动子叶节细胞

利用根癌农杆菌转化萌动大豆成熟子叶节获得了高频率的转基因大豆。从萌发12～16 h的大豆种子切取半片种子作为目标组织,对其子叶节组织进行伤处理后,接种于含有pGB载体的LBA4404农杆菌溶液。pGB载体含有除草剂（phosphinothricin, PPT）抗性基因bar和绿色荧光蛋白基因sgfp。将接种的外植体分别在含有3或5 mg/L PPT的芽诱导培养基、3 mg/L PPT的芽伸长培养基及2～4 mg/L PPT的根诱导培养基上进行了筛选。利用萌发5 d的外植体进行PPT浓度筛选的结果表明,芽诱导、芽伸长及根诱导阶段的PPT浓度分别为5、3及3 mg/L时,转化效率达到最大值,为5.3%。PCR和Southern杂交结果证实了外源基因稳定地整合在大豆基因组中。Northern杂交和GFP分析结果表明被整合的外源基因在大豆细胞中得到了稳定的表达。成熟植株对体外喷洒100 mg/L PPT溶液产生抗性。转化效率达8.9%。     

无籽西瓜子叶离体培养及植株再生研究

以无籽西瓜黑蜜5号无菌苗子叶为材料,对组织培养植株再生的条件进行了详细的研究。研究结果表明：子叶芽诱导的最佳培养基配方为MS＋6-BA3.0mg/L＋NAA0.1mg/L。芽的诱导需要先在黑暗条件下启动,生长分化则须在光下进行。适宜的生根培养基配方为1/2MS＋IAA0.4mg/L和1/2MS＋IBA0.3mg/L。试验初步建立了适用于无籽西瓜遗传转化和快速繁育的子叶再生系统。     

大豆组织培养再生系统的研究进展

大豆因其愈伤组织难以分化、原生质体再生困难等因素,其再生体系一直不够完善。直到20世纪80年代初期,才成功建立了大豆的体细胞胚胎发生和器官发生再生系统。80年代末期原生质体培养获得突破。介绍了大豆器官发生再生系统、体细胞胚胎再生系统和原生质体再生系统的研究进展;对这3种再生系统进行遗传转化的优缺点作了比较;并提出了关于大豆遗传转化再生系统的几点展望。     

影响农杆菌介导的大豆转化效率的因素研究

本研究运用农杆菌介导的大豆子叶节转化的方法,探讨了包括基因型和抗生素在内的对大豆转基因效率有重要影响的多个因素.研究发现通过侵染4周后丛生芽报告基因表达的检测可以早期评估农杆菌的侵染效率,而侵染4周后丛生芽的出芽率刚能准确地反映大豆的再生能力.通过比较9个大豆品种的再生能力和对农杆菌EHA101的敏感性,得出对该法侵染效果最好的受体品种为黑农37;通过对转基因组培系统中广泛运用的4种抗生素组合的抑菌效果及对转化效率的影响的比较,得出最优的抗生素组合为头孢噻肟(cefotaxime)100 mg/L加羧苄青霉素(carbenicillin)500 mg/L.实验还发现,农杆菌侵染大豆子叶节的最佳侵染时间为30～60min,共培养时间为3～5 d,组培筛选体系选用草丁膦代替潮霉素效果更好.     

不同激素条件下大豆原生质体培养和植株再生

以栽培大豆(Glycine max(L.) Merr.)南农86-21、南农86-4、南农73-935为材料，用K8/K8p基本培养基比较了不同原生质体密度和不同激素种类、水平对未成熟子叶原生质体培养的影响，发现它们的差异表现在植板率、产生愈伤组织的速度和频率、愈伤组织的颜色和结构等几方面。对低激素来源南农73-935的愈伤组织的速度和频率、愈伤组     

大豆幼荚子叶原生质体培养及植株再生

本文研究了13个栽培大豆（Glycine max L.）品种原生质体培养的再生能力。从大豆幼荚子叶酶解游离原生质体,用Gellan Gum进行株状包埋,悬浮在含2,4-D 0.1-0.2mg/L,BA0.5-1.0mg/L的改良MS液体培养基中,原生质体培养3天后开始第一次分裂,以后持续分裂。供试基因型间的10天植板率差异显著,变幅为33-67%。30天内形成大量的     

植酸酶phyA基因的密码子优化及其在大豆中的表达

植酸是植物源食品中的主要抗营养成分, 降低植酸含量可有效提高大豆的营养利用率。本文根据大豆密码子使用偏好性, 对无花果曲霉植酸酶phyA基因进行密码子优化, 人工合成了适合在大豆中表达的phyA(b)基因。以pCAMBIA3301为骨架, 构建由大豆凝集素基因启动子和信号肽序列调控的植物表达载体pCBPS-phyA(b)。用农杆菌介导法遗传转化吉林35大豆子叶节。PCR检测表明目的基因已初步整合至大豆基因组中; bar试纸条表明所有阳性植株中均能检测到bar基因的蛋白产物; 除草剂叶片涂抹显示野生型的叶片出现黄化或枯萎现象, 而转基因植株叶片表现正常, 具除草剂抗性; 以半定量RT-PCR共筛选到13株转phyA和19株转phyA(b)阳性转基因大豆植株。通过对转基因大豆T3种子中植酸酶活性、无机磷和植酸磷含量等检测, 证明人工基因phyA(b)比phyA在大豆种子中所表达的植酸酶具有更高的活性, 说明密码子优化有利于提高外源基因的表达。     

农杆菌介导法将热激转录因子8基因转入大豆

植物转化是开展基因工程育种和鉴定基因功能的重要途径。本研究的目的在于向大豆受体导入热激转录因子8（heat shock factor 8,hsf8)基因,以加强目的基因hsp70的表达和增加转基因大豆的抗逆性,同时探索提高大豆转化率的途径。本文以大豆子叶节为外植体,通过农杆菌介导法将hsf8基因转入栽培大豆品种科新3号中,获得了13株抗卡那霉素的转化植株。PCR检测表明,其中的9株呈阳性反应,证明hsf8基因已整合到大豆基因组中。本实验获得的实际转化率为2．39％。文中讨论了选择适宜的种子灭菌方法和大豆受体品种对提高转化率的有效作用。