Bar基因的玉米花粉管通道法转化

通过花粉管通道法利用抗除草剂基因（bar）转化3个玉米自交系,D0代获得35株GUS阳性植株．其中17株PCR阳性植株,除草剂筛选获得抗性植株13株。研究发现DNA溶液浓度影响转化率,当浓度为100μg／ml时,转化率最高,为2．61％。DNA导入时间距人工授粉时间的延长,结实率升高,但转化率显著下降,人工授粉后1d导入DNA产生的转化株最多,为19株,平均转化率为1．35％。     

利用花粉管通道转化谷子DNAj基因获得转基因小麦

为提高小麦的抗旱能力,采用花粉管通道法将本实验室克隆的谷子抗逆相关基因DNAj转入小麦中.对授粉方式、柱头处理方式、质粒DNA浓度及DNA稀释试剂等因素对结实率的影响进行了对比,结果只有授粉方式对结实率的影响有显著差异,其他条件下结实率均未显示显著差异.对转化获得的703株T0小麦植株提取DNA进行分子检测,有1株小麦稳定扩增到了预期的1 260 bp的目的基因片段.虽然转化效率偏低(1.42‰),但说明利用花粉管通道法将谷子的抗逆相关基因DNAj导人小麦是可行的,为创造抗逆性改良的小麦新材料奠定了基础.     

利用花粉管通道法将BcWRKY2抗旱基因导入玉米的研究

利用花粉管通道法将含有PPT抗性筛选标记的BcWRKY2转录因子基因导入优良玉米自交系.采用正交设计对玉米品种、导入时间及DNA浓度等条件进行了优化.对T0代种子进行了除草剂抗性筛选,结果表明玉米品种龙抗11授粉后16h进行导入及DNA导入浓度为200ng/μL时效果最佳.对获得的除草剂抗性植株进行PCR及PCR-Southern检测,得到PCR阳性植株71株,初步证明了外源目的基因已整合到玉米基因组中.     

花粉管通道法在玉米转基因中的应用

对基因工程技术及花粉管通道法的发展及作用机理做了简单的介绍,概括了将外源DNA导入玉米的方式、后代变异的情况及以后的发展方向.     

花粉管通道法转化大豆的分子表征

采用花粉管通道技术将含有gus基因的pBI121质粒DNA导入辽豆14，从处理的100朵花中获得53粒种子。经PCR检测53粒种子的幼苗，共检测出6株阳性植株。采用RT—PCR和GUS组织化学染色法对所获得阳性植株进行检测，其中2株幼苗(T0代17号和33号)均出现阳性结果，进一步对这2株阳性植株进行Southern blot检测，同样获得了阳性结果。上述检测结果表明，gus基因已整合到染色体上并得到了表达。对转基因植株后代进行了PCR跟踪检测，结果从17号株系的28株中检测出19株阳性植株，33号株系的35株幼苗中检测出17株阳性植株，表明gus基因可以在转基因植株后代遗传。本研究结果为大豆花粉管通道转化技术提供了比较充分的分子生物学证据。     

采用花粉管通道法将蛋白激酶基因导入玉米自交系的研究

通过花粉管通道法将ZmPtil,ZmPtil-1,ZmCIPK2三种蛋白激酶基因植物表达载体分别导入玉米自交系吉444,经草丁膦筛选后得40株抗性植株,通过PCR检测其中28株为PCR阳性植株,平均转化率为1.33％,最后收获11株转基因植株.干旱条件下通过对转基因T1植株的单株籽粒产量、千粒重两个指标进行差异显著性和...     

花粉管通道法转化小麦影响因素的研究

以西农1376和中13小麦品种(系)为受体,携带叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT的pCMLA35-1质粒为转化载体,对花粉管通道转化法中的基因型、转化时间、质粒DNA 浓度进行了研究。结果表明：不同基因型、转化时间对结实率影响不显著,质粒DNA浓度对结实率影响显著。在0~700 ng/μl范围内,小麦结实率随着质粒DNA浓度的增加而降低,其中质粒DNA浓度300 ng/μl和500 ng/μl与对照相比结实率差异达到显著水平,而700 ng/μl则达到极显著差异。不同基因型的转化率因转化时间和质粒DNA浓度的不同而有所差异,其中西农1376的适宜转化时间为40~80min,适宜质粒DNA浓度为300~500ng/μl,以500ng/μl×40min处理的转化率最高,而中13小麦的适宜转化时间为80~120min,适宜质粒DNA 浓度为300ng/μl。     

转录因子基因ZmDREB3转化玉米的研究

利用玉米转录因子ZmDREB3基因(Gene ID:EU964828.1)构建了Ubiquitin启动子驱动的植物表达载体PGM0229-ZmDREB3-EP-SPS,以EPSPS基因为抗性筛选标记,通过花粉管通道法将农杆菌EHA105介导的植物表达载体转化到玉米自交系吉444、Mo17中,通过喷洒350mg/L草甘膦除草剂筛选,得到7株草甘膦抗性植株,用PCR检测得到2个同时整合EPSPS标记基因和ZmDREB3目的基因的转基因株系,用PCR-Southern进一步验证,结果呈阳性。以上结果证明外源基因已经被整合到玉米基因组中。     

番茄花粉管通道遗传转化方法

本研究针对授粉后的转化时机对遗传转化效果的影响,采用两种遗传转化方法(处理Ⅰ:授粉后24h切除花柱进行转化;处理Ⅱ:授粉后12h切除花柱进行转化),利用免疫组织化学技术对番茄花粉管通道遗传转化的途径进行研究。结果表明:处理Ⅰ在转化后26～36h,外源DNA从珠被的一侧进入胚囊;处理Ⅱ在转化后12～38h,外源DNA到达胚珠的珠柄处。外源DNA在番茄花柱的移动速度为1.507±0.105mm/h,其通过花柱的理论时间为4.5h。由此看出,不同的转化操作时机对转化率有影响,认为花粉管通道法转化番茄的适宜时期为授粉后24h进行切除整个番茄花柱的转化操作。     

外源DNA导入花粉管通道技术的发展和应用

本文综述了花粉管通道法的创立与发展,以及应用此方法所取得的一系列研究成果,对遗传转化中所涉及的机理和分子验证进行了探讨,并且分析了影响花粉管通道法导入外源基因的因素,进一步比较了该方法较其它常用的转化法的优势与局限性。     

黄瓜花粉管通道法抗虫基因导入及卡那霉素抗性筛选

研究了不同浓度卡那霉素（Km）对未转化黄瓜种子萌发及幼苗生长的影响,建立了转基因黄瓜卡那霉素抗性筛选体系。种子首先播在含Km200mg／L的1／2MS培养基中,能有效地抑制黄瓜幼苗生长,10d后剪掉根系扦插移栽于蛭石中,能促使非转基因植株衰弱或死亡,有效地加速筛选。应用该筛选体系对花粉管通道法获得的抗虫转基因黄瓜T0种子进行初步筛选,获得Km抗性植株,抗性植株筛选率为1．6％,其中8．9％经PCR分子检测为阳性植株,初步证实EQKAM抗虫基因已整合到黄瓜基因组中.     

不同除草剂加倍玉米单倍体的效率

通过比较3种除草剂加倍玉米单倍体的效率,提出了利用除草剂加倍玉米单倍体的新方法。以先玉335、中农大4号和8607×8609三个基因型诱导的单倍体籽粒为材料,利用20、40、80和160 μmol L^-1浓度的甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵作为加倍药剂,在单倍体植株生长到三叶期和五叶期时,用滴心法处理幼苗,选择有花粉的单株自交,收获后调查果穗加倍率;采用细胞学方法观察单倍体的染色体数目和花粉的活性。结果表明,20~160 μmol L^-1的3种除草剂对玉米单倍体加倍均有效果,加倍率在3.42%~26.32%之间。甲基胺草磷、炔苯酰草胺和氟乐灵的加倍率分别为4.29%~26.32%、3.85%~20.81%和3.42%~17.61%;其中80 μmol L^-1甲基胺草磷的加倍效果最佳,使用80 μmol L^-1甲基胺草磷处理3个杂交种的单倍体,平均加倍率分别为25.02%、20.13%和14.99%。方差分析表明,3个基因型间的单倍体加倍率均呈极显著差异,可见使用甲基胺草磷、炔苯酰草胺、氟乐灵可以提高玉米单倍体的加倍频率,但不同基因型单倍体对除草剂的敏感性存在差异。     

玉米抗病基因一致性图谱的构建

发掘和精细定位玉米抗病基因是构建玉米抗病分子育种技术体系的重要基础。利用生物信息学手段,整理文献和玉米基因组数据库中已有的抗病基因定位的信息,借助高密度玉米分子标记连锁图谱IBM2 2005 neighbors,通过染色体映射的方法,绘制了玉米抗病基因的一致性图谱。结果显示,在试验涉及到的14种主要玉米病害的78个抗病主基因或QTL之中,抗病基因在各条染色体上呈不均匀分布,第3、第6、第10染色体上的主效抗病基因较多,第5和第7染色体上的抗病基因较少,且抗病基因呈簇集分布。研究结果为进一步发掘和鉴定玉米抗病基因和建立玉米抗病分子标记辅助育种技术体系奠定了基础。     

不同类型玉米品种饲用营养价值比较

对粮饲兼用玉米鲁单50(LD50)、高油玉米高油115(HO115)和青饲玉米科多4号(KD4)进行比较研究表明: KD4的鲜、干物质产量最高,较LD50高100%、72.2%,粗蛋白和粗纤维的产量也最高,较LD50高80%、149%;HO115的粗脂肪产量最高,较LD50高62%,粗蛋白的产量也较高;LD50的籽粒产量显著高于KD4,但粗蛋白、粗脂肪和粗纤维的产量都最低.不同     

水稻花粉管通道法导入高粱DNA的SSR分子验证

从60对SSR引物中筛选出17对,对供体高粱、受体水稻及其外源。DNA导入后代稳定材料进行了分子验证,结果表明供体高粱与受体水稻间存在多态性、受体水稻与后代稳定材料间出现多态性,供体高粱与部分后代稳定材料间出现相同的扩增带,部分供体与受体共有的特征带在后代中消失、而有些后代出现了供体和受体均没有的扩增带。这表明供体高粱的DNA不同片段已整合到水稻品种中,获得了不同的变异材料,这些。DNA片段能在后代中稳定遗传。     

不同胚乳类型玉米籽粒淀粉粒的粒度分布特征

以超甜玉米(华威6号)、爆裂玉米(特爆2号)、糯玉米(西星黄糯6号)及普通玉米(郑单958)为材料,利用激光衍射粒度分析仪及投射电镜,分析其籽粒淀粉粒粒度分布特征。结果表明,玉米淀粉粒体积分布均为三峰曲线。粒径<2 μm淀粉粒所占的体积最小;>15 μm玉米淀粉粒所占体积较大(超甜2~15 μm淀粉粒体积占的比例最大)。淀粉粒平均粒径为糯>爆裂>普通>超甜。单粒重及总淀粉含量与>2 μm的淀粉粒体积百分比显著相关;其他籽粒品质与淀粉粒分布相关性不显著。普通及超甜玉米淀粉粒大多呈圆形,淀粉粒折叠的花纹多,普通玉米淀粉粒排布稀疏,脂滴含量较丰富,超甜淀粉粒分布非常松散,脂滴较少;爆裂玉米淀粉粒相互挤压成长条形或方形,淀粉粒折叠的花纹粗大,数量少,淀粉粒排布非常致密,脂滴含量非常丰富;糯玉米淀粉粒呈圆形或椭圆形,淀粉粒折叠成的花纹浅且少,淀粉粒分布致密,脂滴含量丰富。由扫描图片知,普通、超甜及糯玉米淀粉粒呈球形,普通玉米凹陷的淀粉粒数量少;糯玉米淀粉粒大小均匀,具凹陷的淀粉粒数量大;超甜玉米淀粉粒表面分布了许多网状结构,淀粉粒未见凹陷,淀粉粒及淀粉粒之间的填充物未充满整个细胞;爆裂玉米淀粉粒为多面体,有凹陷的淀粉粒极少。     

玉米转基因技术研究及其应用

随着植物转基因技术的深入发展,大豆、玉米、油菜和棉花等转基因作物大面积商品化生产为全球的粮食安全做出了巨大贡献。玉米是全球第一大粮食作物,自1986年以来玉米的转基因技术发展较快,其主要的遗传转化方法包括农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法等,农艺性状改良涉及抗除草剂、抗虫、抗病、抗旱、抗盐和品质改良等,其中抗除草剂和抗虫玉米已成为主要的商业化转基因作物。本文综述了玉米转基因技术的研究进展及应用,展望了玉米转基因研究的发展方向。     

抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因表达载体构建及在玉米中的遗传转化

玉米病毒性病害和杂草严重影响其产量和品质。以pCAMBIA5300为基础载体,应用In-Fusion克隆技术构建了双价植物表达载体pCAMBIA5300-Ubi-PKR-CaMV35S-EPSPS,其中含有抗双链RNA依赖性蛋白激酶PKR基因和磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS基因,分别由玉米泛素Ubi启动子和花椰菜花叶病毒35 S启动子启动。以玉米种子黄化苗的茎尖分生组织为受体,用农杆菌介导法进行遗传转化,将抗双链RNA依赖性蛋白激酶基因PKR和抗除草剂草甘膦基因EPSPS导入玉米自交系掖478中,获得转基因植株及其子代。     

玉米热激蛋白基因ZmHSP90-1的克隆及表达分析

HSP90是普遍存在于原核和真核细胞中的一种高度保守的分子伴侣。本研究从玉米中克隆了一个HSP90同源基因, 命名为ZmHSP90-1基因, 并对其进行了初步的序列分析。该基因cDNA序列全长2 371 bp, 开放阅读框2 094 bp, 编码697个氨基酸, 蛋白质分子量约79.98 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明, ZmHSP90-1基因编码蛋白含ATPase位点和HSP90保守结构域, 并与拟南芥、水稻等多种物种的热激蛋白高度同源; 进化树分析表明ZmHSP90-1与拟南芥AtHSP90.1基因关系较近, 蛋白序列相似性达88.3%。目的蛋白亚细胞定位显示, ZmHSP90-1蛋白在细胞质中表达。实时荧光定量PCR分析表明, ZmHSP90-1对非生物胁迫高温、高盐、ABA、低温、干旱均具有明显的应答反应。推测ZmHSP90-1是玉米的一个胁迫相关基因。     

玉米不同基因型气孔特征和叶温差的研究

为了探讨玉米不同基因型和杂种优势在气孔及蒸腾上的特征，对3个高产杂交种(农大108、农大103和中原单32)及其所有亲本进行了气孔形态、气孔频率和叶温差的观察与测量。结果表明，3个玉米杂交种在气孔特征及叶温上都表现出显著的杂种优势，其中农大108和农大103的杂交种气孔长度都表现正向超亲，杂种优势率分别为10．55％和9．30％，但气孔频率为负向超亲(杂种优势率分别为39．25％和20．43％)；中原单32的杂交种在气孔长度和气孔频率都表现正向超亲，杂种优势率分别为9．47％和16．48％；但从3个杂交种组合均值看，气孔长度为正向超亲，气孔频率为负向超亲。3个玉米杂交种的叶温差都表现正向超亲。相关分析表明，气孔长度与气孔频率呈显著负相关(r=-0．6460^*)；气孔长度与叶温差呈正相关，而气孔频率与叶温差呈负相关，但都不显著。