转菊芋凝集素基因棉花研究初报

利用农杆菌介导法,将菊芋凝集素基因(Helanthus tuberosusagglutinin,HTA)转入常规棉花,获得转抗蚜虫基因棉花再生株。分子检测表明,外源基因已整合在转化棉花受体材料中,转菊芋凝集素基因棉花对棉蚜具有一定的抗性。     

棉花品种对棉蚜(Aphis gossypii Glover)抗性筛选及鉴定技术的研究

1983-1985年在河北邯郸,广平对216个棉花品种(系)进行了416品种(次)的抗蚜性筛选鉴定,并对筛选鉴定技术作了研究。根据蚜情指数,将抗蚜性程度分为抗、中抗、感、高感4级,选出多毛早3号等13个抗蚜品种材料;提出了新的蚜害程度分级标准和蚜情指数计算公式,可提高筛选鉴定的效率;室内接虫鉴定技术研究表明,其结果与田问鉴定相一致(r=0.8028,r_(0.01)=0.641);根据不同棉花品种苗期受蚜害后恢复能力(耐害性)的差异,认为棉花品种抗蚜性筛选在苗蚜发生后期进行最为适当,这有利于对品种抗性作出全面评定。     

转HaNAC基因棉花的分子鉴定及遗传稳定性分析

棉花是世界上重要的经济作物之一。为创制和改良棉花抗旱新品种提供种质资源及遗传育种研究提供理论依据,通过染色体步移技术明确外源基因在棉花染色体上的插入位点、序列及染色体信息,研究了转梭梭HaNAC基因的棉花材料对干旱胁迫的响应能力,确定了HaNAC基因的物理位置,鉴定了其遗传稳定性。研究结果如下：(1)本研究对转HaNAC38转录因子基因棉花材料进行了分子鉴定,通过PCR扩增、电泳检测及测序证实了转基因植株中分别存在标记基因和目的基因序列。应用半定量PCR,证明了HaNAC38基因在棉花受干旱胁迫后表达量上调。这些结果说明转HaNAC38基因T6代棉花植株的遗传稳定性。(2)通过标记基因的初步筛选获得阳性植株后,对转基因棉花进行外源基因的检测鉴定,利用获得的序列设计染色体步移引物,通过巢式PCR方法获得转HaNAC38基因棉花的T-DNA序列在基因组中的插入位置,结果定位到棉花基因组A11染色体第26 202 323 bp处。根据已知的棉花基因组信息,通过鉴定,共筛选转HaNAC38基因的棉花材料5个株系,为创制和改良棉花抗旱新品种提供了亲本材料。     

转菊芋凝集素基因烟草的抗蚜性研究

研究了转菊芋凝集素基因对桃蚜的抗性。结果表明 ,转基因烟草对桃蚜具有抗性。同对照植株相比 ,T0 转基因烟草使桃蚜的平均虫头数下降 70 %。在T1 转基因烟草中 ,转hta -b和hta -c基因烟草对桃蚜繁殖的抑制率分别为 5 0 .1 %,64.6%,同时 ,对桃蚜若虫的发育具有明显的抑制作用。初步认为 ,菊芋凝集素基因是一种对同翅目害虫具有抗性的新基因 ,对同翅目害虫的抗虫基因工程具有应用价值     

转基因抗草甘膦棉花室内发芽鉴定抗性方法

以2个转基因抗草甘膦棉花品系以及10个非转基因抗草甘膦棉花品种为材料,进行了室内发芽抗性鉴定。结果表明,含草甘膦溶液的沙床,对棉种的萌发无显著影响;置床8天时所有非转基因抗草甘膦棉花的试验品种均发芽不成苗且无侧根,偶有成苗也是矮小无侧根的畸形苗,且所有萌发的棉种均有明显不规则干枯凹陷的药害症状;转基因抗草甘膦棉花的试验品系均无药害症状,证明利用室内发芽试验鉴定转基因抗草甘膦棉花抗性的方法是准确可行的。     

转基因棉花对棉铃虫抗性鉴定及利用研究初报

 在北京和海南岛南繁基地对我国首批转基因棉花株系进行了抗棉铃虫性综合鉴定试验。结果表明，1龄幼虫取食转基因棉株嫩叶校正死亡率达80%～85%，幼虫越大死亡率越低。在网室内接虫和田间自然感虫的条件下，蕾铃被害率可控制在2%以下，顶尖被害率控制在10%以下，部分株系几乎不受危害。转基因抗虫棉花株系表现出对棉铃虫具有很高抗性和控制危害的能力，对棉铃虫的种群密度具有明显的控制作用。     

转Susy基因对棉花农艺性状的影响

以新陆早13号为受体,对利用花粉管通道法得到的转蔗糖合成酶基因(Sucrose Synthase Gene, Susy)棉花进行研究,比较转Susy基因植株T5代株系与受体新陆早13号形态性状、产量性状和纤维品质的差异,结果表明,Susy基因的导入对棉花各农艺性状有不同程度的影响,各性状变异系数增加,其中果枝数和皮棉产量差异显著;植株叶片和茎秆的表皮茸毛密集,数量比对照显著增加5倍;纤维长度和强度略有增加,马克隆值降低,品质得到改善.有望为棉花品质育种提供优良材料.     

半夏凝集素基因克隆及其对桃蚜的抗性研究

研究了半夏凝集素(Pinellia ternataagglutinin,PTA)基因对桃蚜(Myzus persicae)的抗性。从半夏幼叶中提取总RNA,采用RT-PCR法分离克隆出PTA1基因cDNA片段,该基因在GenBank中登录号为DQ092435。序列分析表明:该cDNA片段全长为810bp,编码269个氨基酸组成的蛋白,具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征,含有3个由4个氨基酸(QDNY)组成的甘露糖专一结合位点,与报道的天南星科凝集素基因氨基酸序列的同源性在72.7%~92.9%。构建了35S启动子控制下的PTA1基因的植物表达载体pBI121PTA1,该载体含有抗卡那霉素的选择标记基因(nptⅡ),利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株。PCR和半定量RT-PCR分析表明:PTA1基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达。抗蚜虫鉴定表明:转基因植株有效地抑制了蚜虫的群体增长率,平均抑制率达77.02%,表明该基因对同翅目害虫的抗虫基因工程有重要的应用价值。     

转基因抗虫棉凝集素的检测

为探讨外源杀虫基因导入对棉花重要防御物质凝集素的影响,同时建立棉花凝集素的灵敏检测方法,采用血凝法检测转基因(Bt、CpTI和外源凝集素基因)棉花中凝集素的变化,并经胰蛋白酶处理鸡血红细胞、不同温度处理和比色法测定棉花的凝集素活性。结果表明,棉花叶片中凝集素水平随棉花生长而发生变化,不同外源基因的导入使棉花凝集活性升高或降低。采用经胰蛋白酶修饰后的鸡血红细胞检测,棉花凝集活性明显提高,最高是未经处理检测的64倍。棉花凝集素具有一定的抗热性,在45℃以下很稳定,但随温度的升高和处理时间的延长活性下降。血凝反应和比色法均能直观、定量地反映棉株中凝集素活性,但后者精度更高。以上研究结果表明,外源杀虫基因的导入引起棉花凝集素水平发生改变,比色法可以作为检测棉株中自身和外源凝集素基因表达后凝集活性的重要手段。     

转TaCRT基因拟南芥植株表型分析及抗性鉴定

为了进一步揭示小麦钙网蛋白基因TaCRT是否参与植物对环境胁迫响应,通过根癌农杆菌GV3101介导法将该基因cDNA克隆转入拟南芥,使其异源过量表达,分析转基因拟南芥纯系和野生型植株在表型上的差异,并对转基因株系的抗盐性进行鉴定。结果表明,过表达TaCRT基因的拟南芥纯系植株在正常培养条件下,植株生长相对旺盛,根系较短,分化的不定根数目较多,而在盐胁迫条件下,与野生型相比,转基因株系的耐盐性较强。     

转蚕丝芯蛋白基因获得高强纤维棉花植株

采用花粉管通道技术,将棉纤维细胞特异表达启动子(E6)驱动的蚕丝芯蛋白基因导入陆地棉品种"泗棉3号"。共注射600朵花,收获497粒种子。通过GUS报告基因组化检测筛选,获得5株GUS阳性棉株。又经卡那霉素涂叶法鉴定,其中4株具有良好的卡那霉素抗性。用依据E6启动子序列和蚕丝芯蛋白基因序列设计的两对引物,对这5株棉花进行PCR扩增,获得1株转蚕丝芯蛋白基因棉株。纤维品质测定结果表明,这株转蚕丝芯蛋白基因棉花T1代纤维比强度达到34.6cN/tex,比对照"泗棉3号"(比强度为28.6cN/tex)提高了21.0%,T2代纤维比强度比对照平均增高23.3%。     

35SP-rolB基因在棉花转基因系基因组中转录稳定性研究

以8个T7代的棉花35SP-rolB转基因系为材料,通过提取转基因株系及对照植株叶片总DNA和总RNA,对各个转基因株系分别进行PCR检测和Northern杂交,研究转基因的遗传稳定性和转录稳定性.结果表明,35SP-rolB目的基因和NPT Ⅱ选择标记基因在经过对转基因系的连续多代定向选择后,在各个转基因系基因组中都...     

Cloning of Partial Sodium Channel Gene From Strains of Fenvalerate-Resistant and Susceptible Cotton Aphid(Aphis gossypii Glover)

The strain of fenvalerate-resistant cotton aphids was selected using fenvalerate insecticide in the laboratory, the resistance factor of the strain was 199.54. Three degenerate primers were designed and used to perform PCR amplification. A cDNA encoding partial sodium channel gene was cloned from the fenvalerate-resistant and -susceptible strains. There were two nucleotide acid differences between fenvalerate-resistant strain and -susceptible strain, resulting in an amino acid mutation, Met→Leu. It is predicted that the mutation is related to the cotton aphid resistance to fenvalerate.     

陆地棉扩展蛋白基因的鉴定与特征分析

目的 扩展蛋白（Expansin）是细胞壁的重要组成部分,在植物的生长发育及逆境胁迫应答等方面均发挥着重要作用。基于全基因组水平系统鉴定陆地棉Expansin基因家族,并通过生物信息学及表达模式分析,为揭示扩展蛋白基因在棉花生长发育中的功能及后续利用奠定基础。方法 利用BLAST和HMMER在陆地棉基因组中搜索并鉴定扩展蛋白基因家族成员;利用ClustalW、MEGA、MCScanX、Prot Param、MEME、SignalP、Euk-mPLoc、FancyGene和DnaSP等软件对其基因序列和蛋白序列进行生物信息学分析。通过RNA-seq数据分析扩展蛋白基因的表达模式和部分同源基因间表达差异,利用qRT-PCR验证部分扩展蛋白基因的表达谱。结果 陆地棉基因组中含有46个EXPA基因、8个EXPB基因、6个EXLA基因和12个EXLB基因,合计72个Expansin基因;四倍体陆地棉中扩展蛋白成员的数量几乎是二倍体棉种（亚洲棉与雷蒙德氏棉）的2倍。除GhA02和GhD06 2个染色体外,其余各染色体上均分布有数目不等的扩展蛋白基因（2—4个）,具有部分同源关系的染色体GhA08和GhD08分别有5个和8个扩展蛋白基因。系统发育树显示,各亚家族成员聚集成群,并且大部分的末端分支均由来源于3个物种的4个（亚）基因组的4个基因组成,如EXPA亚家族的Cotton_A_28454/Gh_A03G0885/Gh_D02G1269/Gorai. 005G142200等等,4个基因之间具有同线性关系。亚细胞定位发现陆地棉所有的扩展蛋白均位于细胞外。基因结构分析显示,扩展蛋白基因由3—5个外显子组成,外显子-内含子结构在进化上高度保守且与氨基酸序列的多样性一致,且在外显子上存在密码子偏好性。RNA-seq数据显示,不同基因在不同时空条件下存在特异性表达,如GhEXPA19A和GhEXPA19D相比其他基因在纤维10 DPA和20 DPA中的表达量很高;在不同的组织（如子叶、新叶、老叶、苞叶）中,GhEXPA24D具有较高的表达量。部分同源基因之间具有不同的表达模式,显示它们之间功能的异化与互补。qRT-PCR结果与RNA-seq数据基本吻合,如GhEXLA3A和GhEXLA3D在纤维发育的伸长阶段高量表达。GhEXPA19D和GhEXLA2D在3DPA的胚珠中表达活跃。结论 陆地棉基因组中含72个扩展蛋白基因,其在DNA水平和氨基酸水平具有一致的结构多样性和进化保守性,在转录水平具有各异的表达模式,显示出家族内成员间功能上的异化与互补。     

棉花黄萎病抗性毒素鉴定的可行性分析

利用病圃鉴定和毒素鉴定,分别对35个具有陆地棉遗传背景的野生棉种质渐渗系和抗、感病对照进行抗黄萎病性鉴定。病圃鉴定结果表明,苏6005、苏6073高抗黄萎病,苏6025、苏6093抗黄萎病,而文5、苏6016、苏6022、苏6026、苏6035、苏6038等22个品种(系)达到耐病标准,鄂荆1号、苏6001、苏6007、苏6023、苏6042、苏6061等11个品种(系)感黄萎病。毒素浸根试验证实,24、48h致萎度不能真实反映供试品种(系)对黄萎病的抗性水平,而毒素浸根72h后,供试品种(系)对黄萎病毒素伤害的抗性存在显著差异。根据苗期毒素鉴定的72h致萎度,能够准确预测供试品种(系)成株期在病圃鉴定中对黄萎病的抗性水平,棉花对黄萎病抗性的毒素鉴定是一种简便、快速、高效、可行的抗病鉴定方法。     

陆地棉PHYB基因生物信息学分析

[目的]对陆地棉PHYB基因有一个全面的认识和生物信息学分析.[方法]在陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库中共鉴定获得2个PHYB基因,这2个基因分别分布在A10和D10亚基因组.利用生物信息学方法对这两个基因进行初步分析.[结果]棉花的PHYB具有其他植物PHYB相同的基序和结构域,不管是数目还是分部位置都比较一致;不同植物的PHYB氨基酸序列同源性比对及构建的进化树都显示棉花的PHYB同可可的在同源性和进化关系上都是最高的,同水稻、玉米等单子叶植物的同源性及进化关系较低;基因结构的比对结果同样显示植物PHYB基因在进化上比较保守;棉花PHYB存在几十个可能磷酸化的位点,这些位点的磷酸化作用可能影响光敏色素的功能及其介导的信号通路.[结论]该研究结果为陆地棉PHYB基因的克隆和功能研究提供了理论基础.     

氰戊菊酯抗性和敏感品系棉蚜部分钠离子通道基因的克隆

 在室内选育出了对氰戊菊酯抗性达 199.5 4倍的棉蚜品系。设计了 3条简并引物进行嵌套式PCR扩增 ,得到了氰戊菊酯敏感品系和抗性品系棉蚜钠离子通道基因IIS4 IIS6区的基因片段。序列分析表明 ,氰戊菊酯抗性品系棉蚜没有发生kdr或super kdr突变 ,但是与敏感品系相比 ,抗性品系钠离子通道基因IIS4 IIS6区有 2个核苷酸发生了突变 (T2A和A34T) ,并由此导致了 1个氨基酸的突变 (M12L) ,推测该突变与棉蚜对氰戊菊酯产生抗性有关     

转Bt基因抗虫棉的筛选和抗性鉴定

2000～2002年采用卡那霉素叶片涂抹法和室内饲喂生物测定法筛选和鉴定转Bt基因棉原始群系"20-1"2代,对单株进行了抗虫性鉴定和抗性级别评价.在供试的321株材料中,筛选出特高抗棉株22株,高抗棉株19株,并将这些棉株的自交铃种子种成株行,进行了纯合株系(抗性基因纯合)的筛选,筛选出特高抗8个株行,高抗10个株行,可进行进一步的转Bt基因棉的品种选育.     

转Bt基因棉的检测和抗虫性鉴定研究进展

综述了转Bt基因棉的检测和抗虫性鉴定的研究概况,分别从外源Bt基因的检测、Bt毒蛋白的检测、标记基因的检测和抗虫性的鉴定4个方面进行了探讨,并提出了一些有待于研究的问题.