蝴蝶兰热激蛋白基因PhHsp70序列分析及对冷胁迫的响应

通过RT-PCR和RACE相结合的方法从蝴蝶兰叶片中克隆了一个热激蛋白基因PhHsp70 c DNA序列(Gen Bank登录号为MG214259),该基因全长为2 239 bp,编码647个氨基酸,与多种植物的HSP70基因具有94%以上的相似性;其编码蛋白包含HSP70结构域,属于胞质型HSP70;系统进化分析显示,该蛋白与铁皮石斛的HSP70蛋白亲缘关系最近;PhHsp70基因在营养器官和生殖器官中均有表达,其中在根中表达水平最高,在花器官中表达水平较低;PhHsp70基因在4℃冷胁迫处理0.5 h表达水平下降,冷胁迫1 h后,表达水平升高,在处理24 h时表达水平最高。由此推测,PhHsp70基因参与蝴蝶兰4℃冷胁迫的生理反应。研究结果可为研究蝴蝶兰热激蛋白在低温胁迫响应中的调控机理提供理论基础。     

玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT4克隆及其低温胁迫下的表达模式

[目的]克隆玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT4,并明确其组织表达特性及在低温胁迫下的表达模式,为深入研究SUT4基因响应低温胁迫的作用机理提供理论依据.[方法]以玉米自交系黄早四幼苗为材料,采用RT-PCR克隆其ZmSUT4基因,分析其生物学信息,构建系统发育进化树,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其组织表达特异性及低温胁迫(4℃)下不同组织中的表达模式.[结果]克隆获得的ZmSUT4基因(GenBank登录号MK541991)全长为1621 bp,开放阅读框(ORF)长度为1506 bp,编码501个氨基酸,编码蛋白的分子量53.36 kD,理论等电点(pI)8.84,具有12个跨膜结构,定位于细胞膜上,既属于易化扩散载体(MFS)家族成员,也属于蔗糖/H+共转运体(GPH)超家族成员,其中第25~447位氨基酸是MFS家族蛋白的保守结构域,第17~484位氨基酸是GPH超家族成员的蔗糖运转子保守结构域GPH-sucrose.ZmSUT4蛋白的氨基酸序列与单子叶植物SUT4蛋白同源性较高,为86%~96%,聚集在同一分支上;与双子叶植物SUT4蛋白同源性较低,为62%~65%,说明该类蛋白在不同物种间高度保守.ZmSUT4基因在玉米的根、茎和叶中均有表达,以根中的表达量最高,其次是叶,茎中的表达量最低.低温胁迫下,ZmSUT4基因在不同组织中表达量模式不同,根和叶中ZmSUT4基因表达量均在胁迫24 h达最大值,分别是低温胁迫前(0 h)表达量的2.21和2.62倍,茎中的ZmSUT4基因表达量在胁迫6 h达最大值,是低温胁迫前表达量的3.01倍.[结论]ZmSUT4基因受低温胁迫诱导表达,推测其是调控玉米响应低温胁迫的关键基因.     

灰飞虱2种热激蛋白基因Hsp70的克隆、分析

灰飞虱[Laodelphax striatellus(Fallén)]是一种分布广,对环境有很强适应性的重要水稻害虫。热激蛋白70(Hsp70)家族是与生物体环境适应最为密切的一类蛋白质。本研究通过RT-PCR与RACE技术克隆灰飞虱Hsp70基因,利用生物信息方法分析了该热激蛋白的特征,采用实时荧光定量PCR技术研究该基因在不同生长发育阶段和不同温度条件下表达变化规律。结果显示:克隆了Hsp70基因的2种c DNA全长序列,分别命名为Ls Hsc70(Gen Bank登录号为KF660252)和Ls Hsp70(Gen Bank登录号为KF660251)。Ls Hsc70全长为2 399 bp,编码657个氨基酸,编码的蛋白质等电点为5.3,分子量为73 000;Ls Hsp70全长为2 468 bp,编码690个氨基酸,编码的蛋白质等电点为5.8,分子量为74 900。Ls Hsc70和Ls Hsp70的氨基酸序列中均含有Hsp70蛋白质家族的3个签名序列及1个ATP-GTP结合位点。系统进化关系分析结果表明它们与多种昆虫的Hsp70氨基酸序列有较高的同源性。不同发育阶段的灰飞虱体内Ls Hsc70和Ls Hsp70呈现出不同的表达模式,Ls Hsc70在雄性成虫阶段表达量达到最大值,而Ls Hsp70的最高表达量在1龄若虫阶段。不同性别的灰飞虱成虫体内Ls Hsc70表达量有显著差异,而Ls Hsp70没有显著差异。高温和低温胁迫都可以诱导灰飞虱体内Ls Hsc70和Ls Hsp70的表达,在-4℃和-9℃的低温胁迫下,Ls Hsc70和Ls Hsp70分别达最大的表达量。在40℃,Ls Hsc70和Ls Hsp70表达水平均在处理后0.5 h时最高。而在-4℃,Ls Hsc70和Ls Hsp70的表达水平均在处理后1 h时达到最大值。结果表明灰飞虱可以通过调节体内的Ls Hsc70和Ls Hsp70表达,来应对不良的环境温度。     

油棕EgNAC33基因的克隆与逆境响应表达分析

应用RT-PCR及RACE技术,克隆了油棕抗逆相关基因EgNAC33的全长cDNA;应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行了分析,同时采用qRT-PCR分析了低温、干旱及高盐胁迫处理后EgNAC33的响应表达情况。结果表明:克隆获得的基因EgNAC33的cDNA全长为1952 bp,含1个长约735 bp的开放阅读框,编码245个氨基酸,该基因编码的蛋白与椰子NAC蛋白的同源性最高;EgNAC33基因受低温及高盐胁迫的诱导,其中,在8℃条件下胁迫8 h时的表达量最高,在高盐条件下胁迫24 h时的表达量最高;但在干旱胁迫下,EgNAC33的表达量基本上不受影响。     

油棕EgNAC33基因的克隆与逆境响应表达分析

应用RT-PCR及RACE技术,克隆了油棕抗逆相关基因EgNAC33的全长cDNA;应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行了分析,同时采用qRT-PCR分析了低温、干旱及高盐胁迫处理后EgNAC33的响应表达情况。结果表明:克隆获得的基因EgNAC33的cDNA全长为1952 bp,含1个长约735 bp的开放阅读框,编码245个氨基酸,该基因编码的蛋白与椰子NAC蛋白的同源性最高;EgNAC33基因受低温及高盐胁迫的诱导,其中,在8℃条件下胁迫8 h时的表达量最高,在高盐条件下胁迫24 h时的表达量最高;但在干旱胁迫下,EgNAC33的表达量基本上不受影响。     

火龙果类锌指蛋白基因片段的克隆及表达分析

锌指蛋白在原核生物与真核生物基因转录的调控中发挥着重要作用.根据火龙果抗逆cDNA 芯片中的一个 EST设计一对引物,采用RT-PCR克隆火龙果类锌指蛋白基因片段,生物信息学分析表明,该片段长334bp,编码 1中含有109个氨基酸残基的肽链,命名为HuZF.该基因序列与其它植物锌指蛋白基因核苷酸序列的同源性均在 70%以上,推测的氨基酸序列与其它植物锌指蛋白的氨基酸序列的同源性达60%以上.RT-PCR分析表明,高盐和 干旱胁迫下,火龙果茎中HuZF 的表达增强,低温胁迫时,HuZF 的表达先减弱后增强,初步推测该基因的表达与 火龙果低温、高盐、干旱等逆境胁迫响应相关.     

菊花脑热激蛋白70基因的克隆及表达分析

采用同源克隆结合RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白70基因(hsp70)的cDNA序列,并通过荧光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在40℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、2、3、6 h)后叶片中hsp70基因的表达差异。结果表明,克隆的cDNA序列全长2 224 bp,与水母雪莲花、紫茎泽兰的hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为88%、98%,表明该序列为菊花脑的hsp70基因序列(GenBank登录号,KJ561911),命名为Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为1 944 bp,其编码的蛋白(647个氨基酸)的相对分子质量约为70 900,含有HSP70家族序列标签。qRT–PCR分析的结果表明,Cnhsp70基因的表达在热激后短时间内迅速上调,热激3 h达到最高,热激6 h时表达量迅速下调。     

紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。     

MaHSFA1和MaHSP70在热处理诱导香蕉抗冷性中的作用

【目的】探讨MaHSFA1和MaHSP70基因在热处理诱导香蕉抗冷性中的作用,为有效延长香蕉贮运期提供参考依据。【方法】从香蕉基因组数据库(http://banana-genome.cirad.fr/)中搜索到MaHSFA1和MaHSP70基因序列,分别设计特异引物,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测这2个基因在香蕉热处理和低温贮藏中的表达情况。【结果】MaHSFA1基因与其他物种的HSFA1基因同源性较低,仅在HSF DNA-bind区域的保守性很高;MaHSP70基因含有一个HSPA1-2,6-8-like NBD区域,且与其他物种的HSP70基因同源性很高。7℃冷藏诱导香蕉果实的MaHSFA1和MaHSP70基因表达量整体上呈下降趋势。经52℃热水处理诱导的MaHSFA1基因表达增强,且在热激处理后0.5 h有一个小高峰;在7℃低温贮藏过程中,经热处理后的MaHSFA1基因表达量在贮藏4.0 h时迅速升高至最大值,之后又迅速下降;MaHSP70基因表达量在热激处理后0.5 h迅速升高至最大值,约是对照处理(未经热激处理)的4倍,之后逐渐下降。在整个试验过程中除7℃贮藏120.0 h外,其他时段热激处理的MaHSFA1和MaHSP70基因表达量均高于对照处理。【结论】采后香蕉果实的抗冷性与MaHSFA1和MaHSP70基因表达增强密切相关,生产上可通过热处理提高香蕉果实的抗冷性,进而延长贮运期。     

大蒜热激转录因子基因AsHSFB1的克隆、亚细胞定位及其表达分析

热激转录因子(HSF)基因是植物热胁迫响应的重要转录调节基因,在植物胁迫应答和其他抗逆反应过程中起着关键作用。为研究大蒜热激反应的分子机制,本研究基于大蒜转录组数据,以徐蒜6号为试验材料,采用同源克隆方法获得编码HSF的AsHSFB1基因。序列分析结果显示,AsHSFB1含有882 bp的开放阅读框,编码293个氨基酸,其蛋白质含有热激转录因子的特征结构域。在进化关系上,AsHSFB1与拟南芥AT4G11660(AtHSFB2B)同源性最高。亚细胞定位结果表明,AsHSFB1蛋白主要定位在细胞核和细胞质上。本研究采用同源重组技术成功构建pCAMBIA1305-AsHSFB1过表达载体,为进一步研究该转录因子基因的功能,培育耐热大蒜品种奠定基础。RT-PCR分析结果表明,不同大蒜品种中,AsHSFB1基因在叶片中相对表达水平均最高,具有组织表达特异性;38℃高温胁迫处理下,徐蒜6号中的AsHSFB1基因相对表达水平在24 h时明显上调;4℃低温胁迫下,徐蒜815和徐蒜6号中AsHSFB1基因相对表达水平的变化趋势相似,均先上升后下降,在处理4 h时相对表达水平达到峰值。     

Characterization of a TaJ Gene from Wheat

A novel J-domain protein gene was cloned from wheat （Triticum aestivum L.） using RT-PCR technology and named as TaJ. The J-domain protein is defined by the presence of a J-domain. The cDNA of T. aestivum gene, TaJ （GenBank accession number： DQ789026）, was 1263 bp and contained a complete open reading frame （ORF） encoding a J-domain protein of 420 amino acid residues. The predicted amino acid sequence of TaJ possesses three functionally essential domains： the Nterminal J-domain which includes the highly conserved HPD tripeptide, an adjacent domain that is rich in glycine and phenylalanine residues （G/F） and a Cysteine-rich zinc-finger domain with four repeats of CxxCxGxG that is important for protein interactions. The C-terminal of TaJ was -CAQQ, a farnesylation motif. The full-length deduced amino acid sequence of TaJ is highly homologous to J-domain proteins from various plant species. Southern blot analysis indicated that a single copy of TaJ existed in wheat genome. The expression pattern of TaJ performed by real-time PCR demonstrated that heat shock （HS） at 37℃ induced the expression of TaJ rapidly and strongly, but the response of the TaJ gene to cold stress was much slower than that to HS. Tissue-specific expression analysis showed that the expression level of TaJ gene was much higher in leaves than that in roots.     

急性高温胁迫对翘嘴鳜幼鱼抗氧化酶和消化酶活性及热休克蛋白基因表达的影响

【目的】从抗氧化酶和消化酶活性及热休克蛋白基因表达层面明确高温胁迫对翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）幼鱼生长及应激生理响应的影响,为实际生产中翘嘴鳜幼鱼培育提供可靠的参考依据。【方法】对2月龄翘嘴鳜幼鱼进行96 h的急性高温胁迫,通过预试验测试高起始致死温度（96 h-UILT₅₀）,采用突变升温方法设常温对照组（26.0℃）和急性高温胁迫组（36.0℃）,分别于胁迫0、6、12、24、48和96 h后取样,使用生化试剂盒测定抗氧化酶和消化酶活性,并以实时荧光定量PCR检测热休克蛋白基因（HSP70α和HSP90α）的表达情况。【结果】翘嘴鳜幼鱼死亡率随水温的升高不断上升,其96 h-UILT₅₀为36.22℃。在96 h的急性高温胁迫过程中,翘嘴鳜幼鱼肝脏超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性呈降低-升高-降低的变化趋势,谷丙转氨酶（GPT）活性及丙二醛（MDA）含量则表现出升高-降低-升高的变化趋势;在消化酶方面,翘嘴鳜幼鱼胃蛋白酶和肠道淀粉酶（AMS）活性呈降低-升高-降低的变化趋势,而肠道脂肪酶（LPS）活性呈升高-降低-升高的变化趋势。在急性高温胁迫过程中,翘嘴鳜幼鱼HSP70α基因相对表达量呈升高-下降的波动式变化趋势,于胁迫12 h时达最高值,在胁迫48 h时出现第2个峰值;HSP90α基因表达呈先升高后降低的变化趋势,于胁迫24 h时上调至最高值;但至胁迫96 h时HSP70α和HSP90α基因的相对表达量仍显著高于对照组翘嘴鳜幼鱼（P<0.05）。【结论】急性高温胁迫对翘嘴鳜幼鱼抗氧化酶和消化酶活性及热休克蛋白基因表达产生显著影响。其中,热休克蛋白基因HSP70α和HSP90α参与高温胁迫应答过程的生理调节,以应对高温胁迫对肝脏细胞的损伤,故可作为高温胁迫应答的标志物。     

热应激条件下小鼠睾丸组织HSP70基因表达谱的研究

本试验建立了不同温度、不同时间热应激实验小鼠动物模型,采用Real-time PCR和Western-blot方法检测了小鼠睾丸组织热应激蛋白70(HSP70)在mRNA和蛋白质水平的表达规律。结果表明:25℃时,HSP70在mR-NA和蛋白质表达水平没有变化;在31℃、34℃和37℃时,随应激时间的延长,HSP70mRNA和蛋白质的表达均呈现先升高后下降的趋势;40℃时,HSP70mRNA和蛋白质始终持续高表达。结论:小鼠受热应激后,睾丸组织HSP70mRNA和蛋白质均随着温度和时间的增加呈规律性变化,本研究为探索HSP70对精液品质的影响奠定了基础。     

小麦吸浆虫小热激蛋白基因Hsp21.9的克隆及在滞育过程与温度胁迫下的表达特性

【目的】小麦吸浆虫（Sitodiplosis mosellana）是最重要的小麦害虫之一,滞育使其度过酷暑和严寒。本研究旨在探讨小麦吸浆虫小热激蛋白（small heat shock protein,sHsp）基因Hsp21.9在滞育中的作用。【方法】利用RACE和RT-PCR技术从小麦吸浆虫滞育前幼虫中克隆Hsp21.9全长cDNA序列;利用生物信息学软件对其核苷酸和编码蛋白特性进行分析;采用RT-qPCR技术分析Hsp21.9在滞育进程（滞育前、滞育、滞育后静息期和滞育后发育）不同阶段幼虫及夏滞育幼虫在短期（≤120 min）极端高温（35—50℃)和越冬幼虫在短期（≤120 min）极端低温（0—-15℃）胁迫下的表达模式;通过大肠杆菌原核表达系统诱导表达及纯化其编码蛋白,采用吸光值法测定重组蛋白抑制猪心苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase,MDH）热聚沉的能力。【结果】克隆获得了cDNA全长为1 087 bp的小麦吸浆虫Hsp21.9,命名为SmHsp21.9(GenBank登录号：KT749988),其开放阅读框长度为582 bp,编码193个氨基酸,其中谷...     

花楸树热激蛋白SpHSP70-3基因克隆与功能分析

  目的  探讨热激蛋白（HSP）在花楸树响应高温胁迫过程中的作用,以期为花楸树引种低海拔地区提供理论基础。  方法  以2 ~ 4年生花楸树实生苗为研究对象,进行了花楸树SpHSP70-3基因的克隆、系统进化分析、组织特异性表达模式以及响应高温胁迫的表达机制研究,并利用农杆菌介导法转化拟南芥,对SpHSP70-3基因在高温胁迫下的响应进行了异源验证。  结果  SpHSP70-3基因开放阅读框全长为2 088 bp,编码695个氨基酸;SpHSP70-3蛋白与蔷薇科梨属的白梨PbHSP70同源性最高。内源性表达分析显示:SpHSP70-3基因在叶片中表达量最高,在花蕾、初花、盛花时表达量偏低;42 ℃处理花楸树后,发现前6 h SpHSP70-3基因表达量没有显著变化,12 h时表达量增至对照组的12倍,24 h时表达倍数最高,为对照组的19倍。对3个转SpHSP70-3基因拟南芥纯合株系（OE1、OE2、OE3）和野生型拟南芥（WT）进行45 ℃高温处理后,OE1、OE2、OE3中的丙二醛（MDA）含量均高于WT,且过氧化氢酶（CAT）活性和过氧化物酶（POD）活性结果均低于WT。此外,SpHSP70-3在转基因株系中的表达量随着处理时间的增加而上升,并且其抑制了正调节因子AtHSP70、AtHSP18.2、AtHsfA1D和AtHsfA1A的表达,同时诱导了负调节因子AtHsfB2B的上调表达。  结论  SpHSP70-3在花楸树响应高温胁迫过程中起负调控作用,初步推测SpHSP70-3是花楸树引种低海拔地区响应高温响胁迫机制中的负调控因子。      

叶用莴苣热激蛋白基因LsHsp70-2711的克隆及高温胁迫下的功能分析

【目的】通过克隆Hsp70相关基因,并利用VIGS分析叶用莴苣热胁迫下Hsp70表达量和形态变化,为解析热激蛋白基因Hsp70在高温胁迫下的响应机制及分子机理奠定基础。【方法】通过同源克隆及RACE技术,获得叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-2711的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在不同温度和不同高温时间下的叶用莴苣热敏品种‘P-S11’和耐热品种‘G-S59’的表达差异,确定基因和高温的相关性。根据VIGS技术,构建p TRV-LsHsp702711瞬时沉默载体,转化农杆菌GV1301,注射法侵染叶用莴苣叶片,三周后经PCR鉴定得到阳性植株。对照组和阳性组在基因表达和形态上进行对比,对照植株和阳性植株热胁迫和干旱处理后再次分析LsHsp70-2711的表达特性,观测形态变化。【结果】LsHsp70-2711 cDNA全长为2 226 bp,开放阅读框为2 154 bp,编码718个氨基酸,与拟南芥(NP_187864.1)、番茄(NP_001266213.1)、水母雪莲花(AAB99745.1)等物种的Hsp70同源性达到80%以上,证明此基因属于Hsp70家族。根据qRT-PCR结果,高温胁迫下该基因在两个品种中的表达均上调,在耐热品种中总体表达水平均高于热敏品种,耐热品种LsHsp70-2711的表达量最大值出现在42℃、60 min,37℃、60 min时热敏品种基因表达量达最大值,且在42℃高温下热敏品种‘P-S11’中基因表达随着胁迫时间的增加受到抑制,而耐热品种‘G-S59’则能长时间保持较高的表达水平,此结果和田间两品种间耐热差异表现相符合。亚细胞定位显示,LsHsp70-2711主要在细胞质中。将构建好的载体侵入叶用莴苣,鉴定后获得阳性植株。由定量PCR结果可知,未进行胁迫处理的阳性植株与对照株相比,LsHsp70-2711表达量下降,茎长明显增长。热胁迫和干旱处理后的阳性植株LsHsp70-2711表达量显著低于对照植株,高温处理对LsHsp70-2711的影响大于干旱胁迫。【结论】LsHsp70-2711属于Hsp70基因家族,其与叶用莴苣耐热性相关。研究结果为解析叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-2711在叶用莴苣高温抽薹方面的功能提供了理论支持。     

叶用莴苣热激蛋白90（LsHsp90）基因的克隆及其在热激下的表达

【目的】克隆叶用莴苣热激蛋白Hsp90基因并探讨其响应热胁迫的相关机制,为揭示叶用莴苣抗热分子机制奠定理论基础。【方法】采用同源克隆和RACE 技术相结合,从叶用莴苣叶片总RNA 中克隆LsHsp90 cDNA 序列。通过实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 分析LsHsp90在叶用莴苣耐热品种Z36和热敏品种S106受37℃和42℃热激后叶片的表达差异。【结果】该基因cDNA序列全长2 330 bp,开放阅读框2 097 bp,编码698个氨基酸,推导的蛋白质分子量约79.8 kD。蛋白质结构预测及同源比对分析表明,LsHsp90基因编码蛋白含ATPase位点和Hsp90保守结构域,并与拟南芥（AY081302.1）、紫茎泽兰（EU269070.1）等多种物种的热激蛋白90高度同源;进化树分析表明,LsHsp90与紫茎泽兰Hsp90基因（EU269070.1）聚为一类。qRT-PCR分析表明,37℃热胁迫下,该基因在耐热品种和热敏品种的叶片中均上调表达;42℃高温胁迫下,热敏品种S106 中下调表达,而耐热品种Z36上调表达。【结论】成功从叶用莴苣叶片中分离克隆到LsHsp90,该基因具有已知物种Hsp90基因的特征,该基因在热胁迫下有不同的表达特征,预示该基因其可能在抗高温胁迫中起重要作用。     

梨CBL基因家族全基因组序列的鉴定及非生物胁迫下的表达分析

【目的】最近在植物中发现了一类Ca²⁺传感蛋白--类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL（calcineurin B-like proteins）,CBL及其靶蛋白CIPK（CBL-interacting protein kinase）构成CBL/CIPK信号网络系统,在植物干旱、盐渍、低温等逆境胁迫应答中起重要作用。鉴定梨基因组中CBL家族基因成员,对其基因进化、结构与表达特征进行分析,为植物CBL基因功能分析与利用提供依据。【方法】通过生物信息学手段,结合梨基因组注释信息,鉴定梨CBL家族成员序列信息;利用MEGA6.0程序进行多序列比对、分类并构建系统进化树;利用per1程序、GSDS工具以及Clustal X软件进行基因结构与保守性分析;通过qRT-PCR技术进行多种非生物胁迫处理下PbCBLs表达分析。【结果】成功鉴定出7个CBL家族成员,基因结构预测表明PbCBL9含5个内含子,其余PbCBLs均含有7-8个内含子;预测的PbCBLs均含4个EF-hand功能域,且相邻EF-hand功能域之间氨基酸数目非常保守;通过系统发育树分析,将7个PbCBLs分为2类;qRT-PCR技术进行不同胁迫处理下杜梨叶片PbCBLs的表达分析,结果表明,在NaCl胁迫下,PbCBL1表达量6 h降至最低,24 h则明显升高;与之相反,PbCBL2和PbCBL3的表达量在6 h达最高,24 h最低;PbCBL4和PbCBL8表达量在3 h明显增加,随后表达量下降;PbCBL9表现明显的上调趋势,24 h达到最大;PbCBL10则在6 h表达量最高。10%（w/v）PEG6000胁迫处理下,PbCBL2、PbCBL4和PbCBL8表达量上调,PbCBL1表达量下调;PbCBL3、PbCBL9和PbCBL10表达量均在6 h最低,12 h和24 h较6 h明显升高,PbCBL3和PbCBL10于24 h表达量达到最高,而PbCBL9在12 h表达量最高。4℃低温处理下,PbCBL2、PbCBL4、PbCBL8表达量上调;而PbCBL1和PbCBL3表达量下调;PbCBL9和PbCBL10表达量表现上下波动的变化趋势,均在3 h有明显增加,随后显著降低。42℃高温胁迫处理下,PbCBL1、PbCBL3和PbCBL4表达量下调;PbCBL2表达量整体上调,6 h达到最高;PbCBL8、PbCBL9和PbCBL10总体呈现相同的变化趋势,在3 h表达量达到最高,随后明显下降。ABA处理下,PbCBL3和PbCBL10表达量下调,PbCBL2与PbCBL8表达量上调;PbCBL1在6 h表达量最高;PbCBL4和PbCBL9表达量呈现相似的变化趋势,3 h明显升高,随后下降,24 h时最低。【结论】成功鉴定的7个候选PbCBLs中,2个基因（PbCBL8和PbCBL9）受盐胁迫诱导表达,3个基因（PbCBL2、PbCBL4和PbCBL8）分别受干旱、低温与ABA诱导表达。PbCBL2在高温胁迫下被强烈诱导可能意味着其在高温应答中发挥重要作用。     

两个尼罗罗非鱼品系Hsp70基因序列比对分析

采用RT-PCR技术,对从美国和埃及引进的两个尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus品系(以下分别简称为美国尼罗和埃及尼罗)热休克蛋白70(Heat shock proteins 70,Hsp70)基因进行扩增并克隆测序。获得两个品系罗非鱼Hsp70基因完整编码区(code sequences,CDS)cDNA序列,全长为1 923 bp,编码为640个氨基酸,含有Hsp70家族3个签名序列DLGTTYS、IFDLGGGTFD和VVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端保守序列EEVD,核定位信号标签KRKHKKDISQNKRALRR;Dank特征基序DLGTT-S-V;胞质Hsp70特征基序EEVD;靠近C端的GGMP4肽序列;2个糖基化位点NKSI和NVSA。结合BLAST分析结果,可以确认,获得的cDNA序列为美国尼罗和埃及尼罗两个品系罗非鱼的完整编码序列。序列同源性分析表明,美国尼罗和埃及尼罗有3个氨基酸位点和12个核苷酸位点不同,美国尼罗Hsp70基因氨基酸序列与莫桑比克罗非鱼同源性最高为99.7%,而与家鼠同源性最低为83.6%。     

甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶基因（SoNADP-IDH）的克隆与表达分析

【目的】甘蔗是C₄作物,是中国最重要的糖料作物和最有希望的能源作物。克隆甘蔗NADP异柠檬酸脱氢酶（SoNADP-IDH）基因,为甘蔗的抗病乃至抗逆育种提供候选基因。【方法】采用双向电泳技术找到差异蛋白点,用质谱技术对相应蛋白点进行鉴定,用RT-PCR技术从甘蔗中克隆SoNADP-IDH,用在线软件对获得的氨基酸序列进行分析,并用qRT-PCR技术研究SoNADP-IDH在不同组织和不同逆境胁迫条件下的表达特性。【结果】质谱成功鉴定出差异蛋白点并克隆获得该基因,命名为SoNADP-IDH,GenBank登录号为KF808326。该cDNA全长1 497 bp,含有1个1 239 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码412个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白为亲水蛋白,不含信号肽,为稳定蛋白,有跨膜区域,为可溶性蛋白,二级结构分析显示,含有α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲,并且α-螺旋和无规则卷曲占据了该蛋白质二级结构的大部分构成。在线软件分析表明该基因含有19个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、4个N-肉豆蔻酰化作用位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点和1个酪氨酸激酶磷酸化位点。多重序列和系统进化树分析表明,SoNADP-IDH所编码的氨基酸序列与其他植物的异柠檬酸脱氢酶（IDH）蛋白有很高的同源性,与玉米的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析表明,SoNADP-IDH在甘蔗的根、茎、叶中均有表达,在甘蔗体内为组成型表达,在生物胁迫（RSD病菌）和4种非生物胁迫下低温（4℃）、干旱（PEG）、高盐（NaCl）和激素（ABA）均可影响SoNADP-IDH在甘蔗体内的表达,且表达模式不同。在PEG模拟的干旱胁迫下,SoNADP-IDH的表达表现出先上调后下调的表达模式,6 h表达量升到最高,之后又开始持续下降,在处理48 h时表达量降到最低;在4℃处理的低温胁迫下,3 h时,SoNADP-IDH的表达量降到最低,之后随着处理时间的延长,SoNADP-IDH的表达量增加,24 h升到最高点,48 h时,又有稍微下降;在ABA作用下,SoNADP-IDH表现出“抑-扬-抑-扬”的表达模式,在处理3 h时SoNADP-IDH表达量有所降低,6 h时升到最高,在处理24 h时降到最低,48 h又有所上升;在NaCl模拟的高盐胁迫下,SoNADP-IDH表现出“扬-抑-扬”的表达模式,SoNADP-IDH的表达量在处理6 h时升到最高,之后开始急剧下降,24 h时降到最低,之后开始有所上升,48 h时基本与对照持平。【结论】从甘蔗中获得了NADP异柠檬酸脱氢酶（SoNADP-IDH）基因,RSD病菌的侵染及上述4种非生物逆境胁迫均影响到SoNADP-IDH在甘蔗体内的表达水平,该基因可能参与了甘蔗抵抗氧化胁迫的过程。