牛奶及奶粉中三聚氰胺残留酶联免疫检测方法的研究

通过4,6-二氨基-2-氯-1,3,5-三嗪与对氨基苯丁酸反应获得三聚氰胺半抗原,再以活性酯法与载体蛋白偶联制备三聚氰胺免疫原或包被原。免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备出针对三聚氰胺的特异性单克隆抗体。采用间接竞争酶联免疫吸附法(ciELISA)建立检测三聚氰胺的标准曲线,线性范围是17.4～345.5ng/mL,50%抑制浓度(IC50)61.3ng/mL。牛奶和奶粉加标回收率在68.1%～91.0%,变异系数在2.4%～14.5%。结果表明,该方法可以满足牛奶和奶粉中三聚氰胺残留分析要求。     

国际科技资讯

国内科研人员建立了基于量子点荧光免疫检测法快速、灵敏检测牛奶中三聚氰胺Analytical Letters报道了中国农业大学Wu Jiao等研究的一种关于牛奶中三聚氰胺检测的新方法。这是一种快速、灵敏、基于二抗-共轭量子点的间接竞争荧光免疫吸附检测方法(icFLISA)。该方法检测限(LOD)为3.88ng/mL,半抑制质量浓度(IC50)为31.58ng/mL,远优于间接竞争酶联免疫吸附检测法     

高效液相色谱荧光检测法测定牛奶中4种氟喹诺酮类药物残留

为了建立一种同时测定牛奶中4种氟喹诺酮类药物(恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星)多残留高效液相色谱检测方法,将牛奶中的残留药物用磷酸-甲醇溶液重复提取2次,正己烷除去脂肪净化后浓缩,流动相溶解后用高效液相色谱-荧光检测器测定。结果表明,4种氟喹诺酮类药物在0.01~1.00μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系(R=0.999 9),在0.01,0.05,0.10,0.50μg/mL和1.00μg/mL 5个浓度添加水平上,平均回收率为77%~93%,样品的批内和批间变异系数均值分别为5.29%和7.83%,定量限均为10 ng/mL。环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星检测限均为5 ng/mL,二氟沙星检测限为8 ng/mL。本研究建立的检测方法简单、快速、灵敏度和回收率高,适用于牛奶中4种氟喹诺酮类药物残留检测。     

牛奶中氟喹诺酮类药物残留量检测方法研究

建立了牛奶中5种氟喹诺酮类药物(达氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和二氟沙星)残留检测的高效液相色谱-荧光检测法.结果表明,环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星在5～300 ng/mL,达氟沙星在1～60 ng/mL浓度范围内,呈良好的线性关系,r均大于0.999 9.方法最低检测限环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星为5 ng/mL,最低定量限为10 ng/mL.达氟沙星最低检测限为1 ng/mL,最低定量限为2 ng/mL.环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星在10、50、100 ng/mL三种浓度添加水平上,平均回收率为70%～94%,达氟沙星在2、10、20 ng/mL三种浓度添加水平上,平均回收率为73%~88%.批内、批间RSD均小于11%.     

牛奶和牛血浆中头孢喹肟HPLC-MS/MS检测方法的建立

建立了头孢喹肟在牛奶和牛血浆中的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法。牛奶样品用10%三氯乙酸沉淀蛋白,两次提取后过Strata-X-C固相萃取柱,30%乙腈洗脱后供HPLC-MS/MS检测。血浆样品用乙腈沉淀蛋白,高速离心后吸取0.2 mL上清液,与0.8 mL水混合后直接检测。以0.1%甲酸水-乙腈为流动相梯度洗脱,流速0.25 mL/min,进样量5!L。头孢喹肟在牛奶中的回收率在76.70%～87.02%之间,定量限为5 ng/mL。牛血浆中的回收率在89.41%～98.25%之间,定量限为2 ng/mL。结果表明,该方法简单快速、灵敏度高,适用于头孢喹肟在奶牛乳和血浆中的残留检测。     

化学发光直接竞争免疫分析法检测猪尿中莱克多巴胺残留

本试验研究建立了猪尿中莱克多巴胺（Ractopamine, RAC）残留的直接竞争化学发光免疫检测方法。合成了莱克多巴胺和辣根过氧化物酶的偶联物（RAC-HRP）,方法的检测限为0.09 ng/mL,空白猪尿中添加浓度为0.5、10和100 ng/mL RAC时,检测范围为0.3～157.0 ng/mL;回收率为76.3%～87.6%,批内变异系数为10.0%～12.2%,批间变异系数为14.2%～15.2%。     

培氟沙星阻断ELISA检测方法的建立

为了建立牛奶样品中培氟沙星的阻断ELISA检测方法,采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法合成了培氟沙星的完全抗原。免疫BALB/c小鼠,制备了血清抗体,并对其血清抗体效价、半数抑制浓度、特异性、牛奶样品的添加回收率等进行了测定。结果:血清抗体的效价为1∶25 600,阻断ELISA的线性检测范围为1.79～100 ng/mL,半数抑制浓度(IC50)为10.12 ng/mL,抗体与其他抗生素的交叉反应率小于0.1%,牛奶样品的平均添加回收率大于85%。     

化学发光免疫分析法检测猪尿中莱克多巴胺残留

本试验运用化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay,CLIA）检测猪尿中莱克多巴胺（Ractopamine,RAC）的残留。检测限为0.01 ng/mL,检测范围为0.036～32.2 ng/mL。添加浓度分别为0.1、1、10 ng/mL,平均回收率为73.2%,批内平均变异系数为9.7%,批间平均变异系数为11.3%。而本研究所建立的化学发光免疫检测方法(CLISA)可以达到检测RAC残留的要求。     

牛奶中玉米赤霉烯酮和氯霉素二合一检测芯片的开发研究

为了开发出能同时检测玉米赤霉烯酮(ZEN)和氯霉素(CAP)的二合一免疫芯片,试验首先制备抗ZEN的单克隆抗体,并结合抗CAP多克隆抗体采用间接竞争ELISA方法进行芯片组装,最终确定定量标准曲线,并进行加标样品的检测。结果表明:共筛选得到3株抗ZEN的单克隆抗体(1C5、2B10、4F3),选择其中的1株杂交瘤细胞1C5制备小鼠腹水,抗体效价为5.12×10~4,半抑制浓度(IC_(50))为6.57 ng/mL。试验建立的免疫芯片对ZEN和CAP的最低检测限分别为2.84 ng/mL、9.49 ng/mL。在牛奶加标回收试验中,ZEN回收率为95.2%～109.8%,CAP回收率为95.1%～100.3%,回收率均较高,且与高效液相色谱(HPLC)法检测结果有良好的相关性,变异系数(CV)小于15.0%。说明该芯片能用于检测实际样品中的ZEN和CAP。     

ELISA方法检测牛组织中的阿维菌素类药物残留

建立一种间接竞争ELISA方法,检测牛组织中的阿维菌素类药物(Avermectins,AVMs)残留。该方法可同时检测牛肝脏和肌肉中的阿维菌素、伊维菌素和埃普里诺菌素残留。标准曲线:y=-45.613x+81.191,R2=0.9951,IC50=4.8ng/mL,线性范围为1.1ng/mL²1.9ng/mL。空白牛肝脏组织中以20、50ng/mL和100ng/g浓度添加时,AVMs回收率为53.8%21.9ng/mL。空白牛肝脏组织中以20、50ng/mL和100ng/g浓度添加时,AVMs回收率为53.8%⁸0.4%,变异系数为3.4%80.4%,变异系数为3.4%¹7.9%;空白牛肌肉组织中以5、10ng/mL和20ng/g浓度添加时,AVMs回收率为70.9%17.9%;空白牛肌肉组织中以5、10ng/mL和20ng/g浓度添加时,AVMs回收率为70.9%¹08.6%,变异系数为3.7%108.6%,变异系数为3.7%¹7.1%。     

沙丁胺醇残留的酶联免疫检测方法的建立

用自主制备的沙丁胺醇特异性抗体建立了针对沙丁胺醇残留的间接竞争酶联免疫检测方法,对该检测体系的灵敏度、准确度、精密度、特异性等性能进行了测定,并与高效液相色谱方法进行了对比性分析。结果显示:沙丁胺醇药物残留的间接竞争酶联免疫检测体系的检测范围为1～80ng/mL,灵敏度为0.58ng/mL,检测限为1ng/mL,回收率为70～99%,与盐酸克仑特罗、硫酸特布他林交叉反应率分别为107%、10%,与盐酸莱克多巴胺及肾上腺素的交叉反应率小于0.01%;采用HPLC方法进行沙丁胺醇药物残留的检测时,其检测范围为10μg/mL～200μg/mL,检测限为1μg/mL,回收率为80～95%。该方法与高效液相色谱法相比灵敏度较高,特异性强,检测结果准确度相近,但是在检测结果稳定性方面逊与HPLC方法。     

磺胺二甲基嘧啶残留检测ELISA方法的研究

本实验对磺胺二甲嘧啶残留检测ELISA反应的各种条件进行了筛选优化,建立了直接竞争ELISA检测方法,该法最小检出量为1.97ng/mL,检测范围5ng/mL～200ng/mL,样品添加回收率为73.20%～91.16%,批内变异系数<5.5%,批间变异系数<9%。与美国进口Max Signal试剂盒相比较,灵敏度为100%,特异性为96.0%,两者的符合率为98.3%。     

Establishment of Indirect Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Tilmicosin in Milk

An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting tilmicosin residue in milk was developed and applied to milk samples after the determination of dilution of coating antigen and antibody to timicosin by using checkerboard method,and the optimization of coating condition,reaction time and temperature,and reaction time of enzyme-labled secondary antibody.The results showed that the 50% inhibition concentration (IC₅₀) of the indirect competitive ELISA was 2.1 ng/mL and the limit of detection (LOD) of tilmicosin in milk was 2 μg/L.The recoveries of tilmicosin added in milk at 5,10 and 20 μg/L ranged from 79.2% to 90.1% with the coefficients of variation (CV) not higher than 9.0%.The indirect competitive ELISA would not react with other common macrolide drugs.The sensitivity of indirect competitive ELISA developed in the study complied to the maximum residue limit of tilmicosin set by China,and laid the foundation for the test kit of the rapid detection of tilmicosin in milk.     

牛奶中替米考星间接竞争酶联免疫吸附检测法的建立

本研究通过棋盘法优化替米考星抗体、包被原浓度,并考察了最佳包被条件,最佳反应温度、时间和酶标二抗最佳反应时间等,建立了替米考星残留的间接竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)并应用到牛奶样本的检测。建立的间接竞争ELISA方法半数抑制浓度(IC₅₀)为2.1 ng/mL,牛奶中替米考星的最低检测限(LOD)为2 μg/L。在5、10和20 μg/L添加浓度下,回收率为79.2%~90.1%,变异系数不高于9.0%。与其他常见的大环内酯类药物无交叉反应。本研究建立的替米考星间接竞争ELISA方法灵敏度达到了残留限量标准要求,为开发可用于牛奶中替米考星的快速检测试剂盒奠定基础。     

农畜产品中三聚氰胺间接竞争ELISA检测方法的建立

利用制备的抗三聚氰胺单克隆抗体建立了间接竞争ELISA方法,采用棋盘滴定法确定最佳三聚氰胺-OVA包被浓度为1.0μg/mL,单抗最佳稀释度为1∶1 000,最佳的封闭液为50g/L的脱脂乳,标准曲线的线性方程为y=-15.12x+107.3(R2=0.997)。批内变异系数(CV)为1.07%～5.53%,批间CV值为3.33%～11.92%,确定此方法精确度良好。利用建立的间接竞争ELISA方法,测定添加有三聚氰胺标准溶液的样品(宠物食品、小麦面筋、饲料、牛乳、鸡蛋),得到三聚氰胺在各样品中的回收率范围分别为宠物食品73.8%～84.32%,小麦面筋67.3%～88.27%,饲料70.3%～85.9%,牛乳83.47%～89.76%,鸡蛋76.2%～87.29%。确定可以利用此间接竞争ELISA方法检测样品中的三聚氰胺含量。     

利用表面等离子体共振生物传感器快速检测牛乳中的三聚氰胺

牛乳中残留的三聚氰胺对人类健康具有重要危害.利用表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)技术,建立一种快速定量检测牛乳中三聚氰胺的方法.以纳米金为媒介将三聚氰胺(melamine,MEL)连接到SPR传感芯片表面,优化最佳抗体用量和再生条件,测试芯片稳定性和方法的准确性.在无污染的牛乳中添加系列质量浓度的MEL,采用竞争抑制法建立抑制标准曲线,并对实际样品进行检测.结果表明:芯片重现性好,重复检测60次相对标准偏差为5.05％,方法检测限为3.24 ng/mL,远低于国际食品法典委员会和国家有关部门规定的残留量.该方法在30 min内完成样品的前处理和检测,适合牛乳生产现场快速定量检测.     

检测牛乳κ-酪蛋白的间接竞争ELISA法与间接ELISA法比较

试验旨在建立一种快速简单检测牛乳κ-酪蛋白（κ-CN）含量的酶联免疫吸附（ELISA）方法,为解决牛乳蛋白掺假问题提供一定的技术支持。以牛乳κ-CN为包被抗原,以酶标抗体（HRP-IgG）为检测抗体分别建立间接竞争ELISA法和间接ELISA法,并对两种检测方法进行分析比较。结果表明：对于间接竞争ELISA法,κ-CN抗原包被浓度为2.5 μg/mL,线性范围为62.5~1 000.0 ng/mL,变异系数< 2%,回收率在98.46%~101.68%;对于间接ELISA法,κ-CN抗原包被浓度为1.56 μg/mL,线性范围为0.098~3.125 μg/mL,变异系数< 1%,回收率在99.10%~101.06%。比较两种检测方法,间接竞争ELISA法检测耗时较短,抗体应用量较少,而间接法不需要包被成本较高的目标标准蛋白,相关系数也较高,但其检测体系组成成分较多,且需包被待测样品,较难组成ELISA试剂盒体系,不宜用于现场检测。因此,大规模制备ELISA试剂盒体系用于快速检测蛋白含量时可采用间接竞争法,不仅抗体应用量少、节约成本且快速、简单,可更好地用于科研实践。     

建立水产品中己烯雌酚残留ELISA检测方法

本试验利用己烯雌酚(DES)单克隆抗体,通过优化反应条件,加标回收试验,确定ELISA检测方法相关参数,建立了己烯雌酚残留的酶联免疫吸附(ELISA)检测法。试验结果显示,包被抗原最佳浓度为2μg/mL,DES单克隆抗体最佳稀释倍数为1∶3×104;标准曲线呈线性相关,相关系数R2=0.9956,IC50=1.103 ng/mL,最适检测范围为0.125~128 ng/mL,检测敏感度为0.077 ng/g;批内和批间变异分别为6.14%和7.48%;鳝鱼肌肉组织的加标回收率为77.6%~94.6%;特异性试验结果表明,该单抗与己烯雌酚单羧丙基醚交叉反应率为112.7%,与其它水产禁用药物交叉反应率0.1%。     

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛乳中19种β-受体激动剂残留

建立同时检测牛乳基质样品中19 种β-受体激动剂类兽药残留的方法。样品经酸化乙腈溶液提取，利用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱通过式净化处理除去磷脂，使用超高效液相色谱-串联质谱仪进行检测。结果表明：经过前处理方法与仪器条件优化后，19 种β-受体激动剂质量浓度在0～10 ng/mL呈良好线性关系（R2≥0.995）；牛乳中19 种β-受体激动剂添加量为0.2～1.0 μg/kg时，加标回收率均为70%～110%，相对标准偏差＜15%。本检测方法前处理简单快捷，具有较高灵敏度和稳定性，可以满足牛乳中β-受体激动剂类兽药残留的快速检测。