蛇毒类凝血酶基因在大肠埃希菌中诱导表达及影响因素

将蛇毒类凝血酶基因(TLE)亚克隆到原核表达载体pMAL-p2X上,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达;同时采用不同的OD值、诱导时间I、PTG浓度和诱导温度对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因重组表达质粒pMAL-p2X进行了条件优化。研究发现,不同的诱导时间、IPTG诱导浓度和诱导温度与融合蛋白表达量有很大关系。SDS-PAGE结果显示,当OD值为0.5,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为37℃时,诱导3 h后蛋白表达量最高,超出此范围可使表达量显著减少。在优化诱导条件后,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白量的66%。     

家蚕抗菌肽Cecropin-XJ的原核优化表达及活性检测

Cecropin-XJ是一种从家蚕幼虫体内分离纯化的具有很强热稳定性、酸碱适应性和广谱抗菌性的新型家蚕抗菌肽。以融合不同标签的表达载体构建pET28a-Cecropin-XJ、pET30a-Cecropin-XJ、pET32a-Cecropin-XJ、pMAL-p2X-Cecropin-XJ重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,并优化诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度等条件,通过对目的蛋白表达的检测分析,选择、建立Cecropin-XJ在大肠杆菌中高效、可溶性表达的技术体系。试验结果表明:采用构建的重组原核表达载体pET32a-Cecropin-XJ在IPTG终浓度为0.8 mmol/L、培养温度为37℃的条件下诱导5 h,目的蛋白的表达量可达10 mg/L,重组蛋白主要以可溶性表达产物形式存在,可溶性蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,经金属螯合层析进一步纯化后的Cecropin-XJ融合蛋白纯度可达90%以上。体外抑菌试验显示Cecropin-XJ融合蛋白对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌活性。     

巴马小型猪SLA-2和β2m复合体蛋白的构建及二级结构测定分析

以巴马小型猪为研究材料,克隆SLA-2和β2m基因。然后采用剪接重叠延伸PCR(Splicing overlap exten-tion PCR,SOE PCR)法,将SLA-2的胞外区和β2m的成熟肽部分通过一富含甘氨酸/丝氨酸的Linker(G4S)3连接,形成SLA-2-Linker-β2m。将SLA-2-Linker-β2m在pMAL-p2X系统上表达,其融合表达蛋白分别经过West-ern-blot、纯化及Factor Xa切割,分离纯化单体蛋白。圆二色谱(Circular dichroism spectrum,CD)测定蛋白的二级结构。结果显示,重构表达的复合体融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m大小为84.1 ku。切割后去除MBP的单体蛋白大小为41.6 ku。圆二色谱分析单体蛋白和融合蛋白二级结构元件α-螺旋、β-折叠、转角和随机卷曲的符合率分别达到了100%、97.3%、97.1%和97.9%,揭示重构的复合体具有正确的二级结构,可以用于体外多肽结合等研究。     

黄粉甲抗冻蛋白AFP84a原核表达条件的优化和纯化

为纯化黄粉甲抗冻蛋白AFP84a,对已构建的重组大肠埃希菌TBI诱导表达,对诱导温度、初始菌浓度、IPTG浓度及诱导时间等表达条件进行优化后,纯化该重组蛋白.通过分析比较,建立了目的蛋白表达的最优条件:温度25℃,初始菌OD600=0.6;IPTG终浓度0.5 mm01/L,时间8 h.SDS-PAGE及Bandsca...     

猪圆环病毒2型ORF2截短基因的原核表达与纯化

对重组原核表达载体pET-ORF2的表达条件进行优化,结果表明,最佳IPTG诱导浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时间为5h。在最佳诱导条件下获得猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的基础上,利用HisBind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,再分别用SDS-PAGE电泳和Westernblotting对纯化产物的纯化效果及特异性进行检测,结果显示表达产物纯化良好,并能被PCV-2阳性血清识别,具有良好的抗原性。     

鸡β2-微球蛋白的基因克隆与原核表达

本研究通过RT-PCR从正常鸡外周血淋巴细胞总RNA中扩增chβ2m 基因全长片段,然后将其克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG对其进行诱导表达,利用HiTrap亲和柱对表达产物进行纯化。结果显示,采用RT-PCR扩增出chβ2m基因全长约360 bp,编码120个氨基酸,与基因库公布的相一致,同源性为100%;经0.8 mM IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析发现chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于细菌裂解上清;利用His标签纯化该蛋白, SDS-PAGE分析仅见约34 kDa大小的chβ2m融合蛋白条带;Western-blot分析表明,纯化后的chβ2m融合蛋白与特异单克隆抗体反应呈现特异性的条带。以上结果证实,本研究成功表达并获得了纯化的可溶性chβ2m融合蛋白,为进一步对chβ2m结构及其功能研究奠定基础。     

禽呼肠孤病毒σNS蛋白的原核表达及纯化

对重组表达质粒σNS-pGEX-4T-1 IPTG的诱导浓度、诱导时间和诱导温度等条件进行了试验。当细菌的D600值为0.55～0.65时,IPTG最佳诱导浓度为0.8mmol//L,最佳诱导时间为4h,最适诱导温度为28～37℃,表达的目的蛋白相对分子质量约为66200,约占菌体总量的31.5%～33.3%。37℃及32℃诱导时,目的蛋白σNS主要以包涵体的形式存在;28℃诱导时目的蛋白主要以可溶性的方式表达。利用28℃诱导表达目的蛋白,用谷胱苷肽活化的Sepharose 4B亲和层析柱纯化,测定纯化蛋白的纯度与浓度,并对纯化的蛋白进行Western-blot分析。结果显示,纯化后的目的蛋白纯度达93%,质量浓度为0.91g/L,并能与禽呼肠孤病毒阳性血清发生特异性反应。     

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒(canine parovirus,CPV)VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPVVP2基因插入原核表达载体pET-32a(+)中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900bp左右的载体条带和1 755bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0mmol/L IPTG、诱导5h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

猪圆环病毒2型ORF2可溶性表达条件的优化

为探索猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在大肠杆菌中高效可溶性表达的条件,扩增ORF2基因构建重组表达质粒p ET30a-ORF2,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态获得重组表达菌;通过改变菌体培养温度和时间、诱导温度和时间、溶解氧量、IPTG及CaCl_2浓度,实现目的蛋白高效可溶性表达。结果表明:重组表达质粒p ET30a-ORF2经酶切及测序证明构建正确,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,其最佳表达条件为:在500 mL培养瓶中加入200 mL LB卡那霉素阳性培养基,菌体于37℃培养4 h后,分别加入IPTG及Ca Cl2至终浓度为0.6 mmol/L及0.06 mol/L,30℃诱导表达4 h;重组Cap蛋白的最高表达量占总蛋白的55.9%。说明优化后可实现猪圆环病毒Cap蛋白的可溶性表达,这为进一步研究该蛋白的结构及其生物学特性奠定了基础。     

H9N2禽流感病毒HA蛋白的原核表达与鉴定

为了实现H9N2亚型禽流感病毒的HA基因在原核系统中高效表达,试验参考GenBank发布的禽流感病毒A/chicken/Gansu/2/99(H9N2) HA基因序列(登录号为EF070733.1),优化该密码子,化学合成HA基因,并将该基因连接至pET-28a(+)质粒载体中,构建pET-28a(+)-HA重组质粒,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后诱导表达,并优化诱导温度(16,25,30,37℃)、IPTG诱导浓度(0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mmol/L)及诱导时间(2,4,6,8,10 h),用His-tag镍柱亲和层析纯化HA蛋白,并对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定。结果表明:成功构建重组基因工程菌pET-28a(+)-HA/BL21(DE3),其在30℃条件下,添加IPTG终浓度为0.8 mmol/L,诱导6 h时,HA重组蛋白表达量最佳。经His-tag镍柱纯化后在预期的63 ku处出现蛋白印迹条带。说明HA蛋白在大肠杆菌中成功表达。     

绵羊肺腺瘤病毒受体Hyal-2原核表达诱导条件的优化及其表达产物的鉴定

为了提高绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2(Hyal-2)在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量,试验对含pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒的BL21(DE3)重组菌原核表达条件进行了优化。结果表明:诱导剂IPTG浓度、作用时间、温度对目的蛋白的表达影响很大,在37℃条件下加入不同终浓度的IPTG(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L)对重组菌诱导4 h,在终浓度为0.4 mmol/L时目的蛋白的表达量最高;加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG,在37℃条件下诱导,在不同时间点(2,4,6,8小时)取样,在作用时间为2 h,37℃条件下表达的目的蛋白主要以包涵体形式存在,当温度降低时可溶性形式明显增加。通过对诱导条件的优化和摸索发现,绵羊肺腺瘤病毒受体Hyal-2原核表达在诱导剂IPTG浓度为0.4 mmol/L、作用时间为2 h、温度为37℃时目的蛋白的表达量最高。     

猪白细胞介素-2重组蛋白的原核表达及其生物学活性分析

用已构建好的重组表达载体pET30-IL2转化BL-21E.coli,挑取单克隆,利用诱导剂IPTG诱导表达;通过改变诱导剂的浓度、诱导的时间来摸索最佳诱导条件,在最佳诱导条件下大量表达,并利用镍层析柱纯化重组蛋白,用MTS法测定其生物学活性。结果表明,表达产物经SDS-PAGE分析,表达出25ku的融合蛋白,表达产物主要以包涵体的形式存在,最佳的诱导剂浓度为0.1mM,最佳的诱导时间为4h;对表达产物的包涵体处理后,用镍琼脂糖凝胶FF纯化,所得蛋白的纯度约在90%以上。通过透析除去部分尿素,复性后在体外利用MTS法检测其生物学特性,结果表明其仍具有较好的生物学活性,这为进一步大量制备和研究猪IL-2重组蛋白奠定了基础。     

双峰驼TLR2多克隆抗体的制备及其在免疫组化检测中的应用

为了制备兔抗双峰驼Toll样受体2(TLR2)的多克隆抗体并鉴定其活性,试验选择双峰驼TLR2基因序列,选取编码区,经软件分析预测该区域编码蛋白的主要氨基酸抗原位,选择对应的核苷酸序列进行基因合成,构建双峰驼TLR2重组质粒(pET28a-TLR2);通过原核表达系统诱导pET28a-TLR2表达,并优化异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)表达条件;表达的蛋白溶解变性后,与Ni-NTA镍柱填料结合,经亲和层析法纯化,用纯化后的蛋白免疫新西兰白兔并制备多克隆抗体;利用SDS-PAGE鉴定蛋白表达和纯化情况,间接ELISA试验、Western blot检测及免疫组化验证并评价多克隆抗体的效价与反应性。结果表明：成功表达双峰驼TLR2重组蛋白,大小约为64 kDa,最佳诱导表达条件：IPTG浓度为0.4 mol/L、诱导时间为5 h,蛋白质以包涵体的形式表达;抗体效价为1∶256 000,能特异性识别目的蛋白;在双峰驼十二指肠肠系膜淋巴结和脾脏中,抗体能特异性识别双峰驼TLR2阳性细胞,细胞类型以单核/巨噬细胞为主,具有良好的特异反应性。说明成功制备的兔抗双峰驼TLR2多克隆抗体具有良好...     

应用发酵罐高密度生产日本血吸虫重组蛋白Sj28GST工艺的研究

为了大量表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,本文采用葡萄糖作为碳源,在不同的培养温度、种子液接种量、IPTG浓度、IPTG诱导时间等培养条件下进行高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,分别用Bradford法和比浊法分析重组蛋白Sj28GST的浓度和重组大肠杆菌的密度.优化应用发酵罐高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST的培养温度、种子液接种量、IPTG浓度、IPTG诱导时机等培养条件.研究结果表明,在培养温度37℃、种子液接种量7%、溶解氧浓度保持20%以上、pH 7.2左右、用0.7mmol/L IPTG在重组大肠杆菌TB1开始培养后5 h进行诱导,细菌密度明显提高,获得的重组蛋白Sj28GST的表达产量最高,为74.32 mg/L发酵液,菌体密度达到13 OD左右.     

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒（canine parovirus,CPV）VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPV VP2基因插入原核表达载体pET-32a（+）中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 755 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导5 h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64 ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

致倦库蚊防御素基因的克隆与原核表达及蛋白纯化

以冈比亚按蚊防御素(Defensin)氨基酸序列为种子序列,在致倦库蚊EST库中查找相似序列。通过RT-PCR技术,克隆获得致倦库蚊防御素编码序列。将致倦库蚊防御素成熟肽基因片段定向克隆至原核表达载体pET32a(+),构建致倦库蚊防御素重组表达质粒pET32a-DEF,导入大肠埃希菌Rosetta中表达,并比较不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同诱导温度对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件,重组蛋白经His-镍蛋白纯化柱纯化。结果表明,致倦库蚊防御素基因编码区全长300bp,编码99个氨基酸。pET32a-DEF最佳诱导表达条件为,IPTG浓度0.2mmol/L,诱导时间为4h,诱导温度为37℃,经纯化获得大小约29ku的重组蛋白,这为进一步研究该蛋白功能奠定了基础。     

抗菌肽Cecropin P1基因表达载体构建与表达

根据大肠杆菌的密码子偏好性,人工设计并合成了3条抗菌肽Cecropin P1基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到抗菌肽Cecropin P1基因,将此基因克隆到原核表达载体pMAL-p2X中,然后将重组质粒pMAL-p2X-Cecropin P1转化E.coliTB1,经IPTG诱导进行融合表达,以Amylose Resin亲和层析纯化。通过SDS-PAGE分析,融合蛋白MBP-Cecropin P1表达与纯化成功。抗菌肽Cecropin P1基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用研究打下基础。     

猪瘟病毒E2亚单位蛋白与集落刺激因子的融合表达及其免疫效果分析

优化了工程菌BL21-E2 A/D-GM-CSF(含有783 bp的E2 A/D-GM-CSF融合基因)的原核表达条件,结果表明诱导的最佳时间和诱导剂IPTG的最佳用量分别为4 h和0.8 mmol/L。在此基础上,大量诱导表达融合蛋白后经Ni-IDA蛋白质层析柱纯化,Western-blot鉴定纯化蛋白具有抗原活性。将融合蛋白与福氏佐剂制成亚单位疫苗后免疫试验小鼠,并与E2 A/D蛋白、猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)进行免疫效果比较,结果显示E2 A/D-GM-CSF亚单位疫苗免疫小鼠后能够产生抗猪瘟抗体,并且抗体水平明显高于E2-A/D免疫组和HCLV免疫组。研究表明GM-CSF经融合表达后对E2-A/D蛋白有显著的免疫增强作用。     

猫冠状病毒S蛋白生物信息学分析与原核表达

为了研发基于S蛋白的FCoV诊断试剂盒和疫苗,试验采用生物信息学分析方法分析表达FCoV S蛋白,确定含有抗原表位的蛋白可表达区域,并在大肠杆菌中原核表达重组蛋白,筛选重组蛋白表达条件,鉴定重组蛋白的免疫原性。结果表明：Ⅰ型FCoV S蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占25.82%、28.14%、4.23%和41.80%;有4个比较明显的亲水性区域与1个明显的疏水性区域;该蛋白质具有穿膜螺旋结构与信号肽,并存在3个可能性很高的N-糖基化位点与S蛋白表面存在46个氨基酸较为暴露的片段。以S蛋白1 127～1 400 aa片段作为体外表达目的片段,命名为S_1127-1400aa;重组蛋白最佳诱导温度为37℃、IPTG最佳诱导浓度为0.1 mmol/L、最佳诱导时间为5 h;重组蛋白以包涵体形式表达;成功纯化重组蛋白S_1127-1400aa;与FCoV阳性血清有良好的免疫原性。说明试验成功表达并纯化的FCoV S蛋白片段,该蛋白质具有良好的免疫原性。     

刚地弓形虫抗原基因SAG2的克隆、表达和纯化

目的克隆刚地弓形虫抗原基因SAG2,并在大肠杆菌中进行高效表达及纯化。方法设计引物从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列,构建pGEX-4T-SAG2重组质粒,双酶切鉴定后,在大肠杆菌中进行表达,并对其表达条件进行优化,所表达蛋白用GST亲和层析柱进行纯化。结果经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白约为41KD。Western-blotting表明该蛋白能与兔抗弓形虫血清特异性结合。培养基2×YTA,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间3 h,培养温度30℃,摇瓶转速220 r/min是GST-SAG2融合蛋白表达的最佳条件,且得到的是可溶性融合蛋白GST-SAG2。结论得到高效表达的SAG2抗原蛋白,为建立弓形虫病快速免疫诊断试剂盒打下基础。