西洋参内生真菌分离鉴定及生防特性

为促进西洋参病害的生物防治研究,通过采用纯培养方法分离纯化西洋参内生真菌,获得58株内生真菌,通过形态学鉴定和显微观察初步确立了16株菌,提取纯化出其中13株真菌DNA,选用真菌通用引物ITS1和ITS4对DNA进行ITS特异性扩增,提交测序分析,构建系统发育树。确定其分属于:镰孢属(Fusarium)、毛束霉属(Trichurus)、葡萄孢属(Cinerea)、亚黑团孢属(Periconiella)、棘壳孢属(Pyrenochaeta)、链格孢属(Ilternarsa)。同时对菌株的生防作用进行研究,其中14株针对立枯病、根腐、茎腐、液斑水浸木4种病原菌表现出不同程度的拮抗性,占分离菌株的87.5%。试验表明西洋参内生真菌多样性丰富。     

篦子三尖杉内生真菌的分离鉴定和抑菌活性分析

珍稀濒危药用植物篦子三尖杉(Cephalotaxus oliveri Mast)是临床白血病药物三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱的重要来源,因此,篦子三尖杉的内生真菌具有潜在的药用价值.通过从篦子三尖杉中分离纯化,筛选出16株外观差异较大的菌株,其中4株无产孢结构.经显微结构和ITS分子鉴定,发现其中11株属于链格孢属.抑菌试...     

广东化橘红内生真菌多样性分析

通过组织分离方法对广东省化州市橘红种植园内所采的化橘红（Exocarpium citri Grandis）果、枝、叶组织内的内生真菌多样性进行研究,并采用形态与分子生物学相结合的方法鉴定菌株. 结果显示,从化橘红果、枝、叶600个组织块中,共分离得到404株内生真菌. 依据形态鉴定及ITS序列分子鉴定,初步鉴定379株内生真菌,并将其分为16个分类单元,经鉴定归于镰刀菌属(Fusarium)、炭疽菌属(Colletotrichum)、色二孢菌属(Lasiodiplodia)、间座壳属(Diaporthe)、光黑壳属(Preussia)、稻黑孢菌属(Nigrospora)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、弯孢属(Curvularia)、隔孢伏革属(Peniophora)、叶点霉属(Phyllosticta)、枝孢属(Cladosporium)、球腔菌属(Mycosphaerella)、假尾孢属(Pseudocercospora)、附球菌属(Epicoccum)、拟层孔菌（Fomitopsis）和毛霉属Mucor）,其中炭疽菌属与间座壳属是化橘红的优势菌株,其相对频率分别为44.6% 和34.2%,远远高于其他类群. 内生真菌在枝组织中的分离率为91%. 研究结果表明化橘红内生真菌分布具有一定的组织特异性,为进一步从化橘红内生真菌中筛选活性中药成分提供了新思路.     

贵州道地药材杜仲内生真菌的分离及鉴定

[目的]开发有地域特色的杜仲内生真菌资源,为杜仲内生真菌多样性和内生真菌的开发利用提供参考。[方法]采用传统的组织培养法从毕节市杜仲中分离内生真菌,对得到的内生真菌进行形态学和真菌rDNA的居间序列(internal transcribed spacer,ITS)鉴定。[结果]从毕节市杜仲中分离得到93株真菌,经鉴定分为拟茎点霉属(Phomopsis sp.)、间座壳属(Diaporithe sp.)、黑孢属(Nigrospora sp.)、粪壳菌属(Sordariales sp)、黑附球菌(Epicoccum rnigrum)、小光壳属(Leptosphaerulina sp.)、锐顶炭角菌(Xylaria apiculata)、刺盘孢属(Colletotrichum sp.)和大白栓菌(Trametes lactinea)共9属,其中拟茎点霉属和间座壳属为优势菌属,分别占54.83%和26.88%。[结论]贵州杜仲内生真菌多样性丰富,杜仲内生真菌炭角菌属、大白栓菌为我国首次报道。     

西藏3种疯草中合成苦马豆素内生真菌的鉴定

 【目的】从西藏毛瓣棘豆、冰川棘豆、茎直黄芪中分离内生真菌。【方法】应用薄层色谱法、气相色谱、气相色谱-质谱联用法检测内生真菌中的苦马豆素（swainsonine,SW）,筛选可生成SW的内生真菌;应用聚合酶链反应对真菌的ITS序列和IGS序列进行扩增,并根据ITS序列信息构建系统发育树,确定其种属分类;对IGS序列进行限制性酶切,并分析酶切产物。【结果】从3种疯草中分离到可以产生SW的4株内生真菌,各菌的形态、ITS序列的同源性与埃里格孢属真菌较为接近,系统发育分析表明4株真菌均为棘豆埃里格孢菌。ITS序列和IGS序列的限制性片段的分析表明,4株真菌遗传距离较近,但仍存在种间变异,可能为棘豆埃里格孢菌的不同亚种。【结论】本研究结果为探讨内生真菌合成SW机理研究奠定了基础,为动物疯草中毒病的防除和疯草资源的合理利用提供了新思路。     

通过ITS序列分析鉴定云南重楼内生真菌

采用组织分离法从云南重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)根、根状茎和叶3个部位的组织块中分离出内生真菌,并对这些内生真菌进行了传统形态学和分子生物学(ITS序列)鉴定。共分离到内生真菌26株,鉴定为8属9种,其中从叶中分离出24株,从根中分离出2株,鉴定为1属1种,即球毛壳菌(Chaeto miumglobosum)。在分离出的9种内生真菌中,优势菌种为1号菌和3号菌,分别被鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和博宁炭疽菌(Colleto trichumboninense),分离率分别为23.07%和19.23%。     

通过ITS序列分析鉴定云南重楼内生真菌

采用组织分离法从云南重楼(Paris polyphylla var.yunnanensis)根、根状茎和叶3个部位的组织块中分离出内生真菌,并对这些内生真菌进行了传统形态学和分子生物学(ITS序列)鉴定。共分离到内生真菌26株,鉴定为8属9种,其中从叶中分离出24株,从根中分离出2株,鉴定为1属1种,即球毛壳菌(Chaeto miumglobosum)。在分离出的9种内生真菌中,优势菌种为1号菌和3号菌,分别被鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和博宁炭疽菌(Colleto trichumboninense),分离率分别为23.07%和19.23%。     

湛江金银花内生真菌多样性研究

为了解湛江金银花内生真菌的多样性,比较分析不同地区金银花真菌种类差异.采用真菌形态鉴定同时结合真菌ITS序列方法对金银花内生真菌的多样性进行研究.结果从湛江金银花分离鉴定了内生真菌17株,分别属于9个属17个种,其中拟盘多毛孢属Pestalotiopsis为优势属,占分离总株数的29.41％,叶部分离的主要是木霉属Trichoderma和拟茎点霉属Phomopsis,茎部分离的是镰刀菌属Fusarium,花部分离得到的主要是拟盘多毛孢属Pestalotiopsis.不同组织部位的湛江金银花内生真菌在数量和种群组成中存在差异,表现出较丰富的多样性.     

篦子三尖杉产高三尖杉酯碱内生真菌的分离与鉴定

为从药用植物篦子三尖杉中分离筛选产高三尖杉酯碱的内生真菌,采用枝叶外植体表面消毒后接种在PDA平板基上培养的方法分离筛选内生真菌,并对分离菌株进行了HPLC分析和ITS分子鉴定。结果表明:筛选出的10个菌株菌落形态和显微结构有明显差异,其中,gyzy-7、gyzy-8、gyzy-9和gyzy-11具产孢结构;gyzy-6、gyzy-8和gyzy-9可产生高三尖杉酯碱;gyzy-6为裂褶菌属,gyzy-8为叶点霉属,gyzy-9为平革菌属真菌。从篦子三尖杉中初步分离出产高三尖杉酯碱的内生真菌。     

汤阴北艾内生真菌的分离鉴定与系统发育分析

对取样于河南汤阴县扁鹊庙内的艾草样品进行表面消毒后,进行内生真菌分离、纯化,基于5.8S-ITS区序列对所得菌株进行种属鉴定,并通过MEGA 7.0软件构建系统发育树。结果表明,从汤阴北艾的茎、叶中共分离得到13株内生真菌,隶属于3属(链格孢属Alternaria、耙齿菌属Irpex、球毛壳属Chaetomium)6种(链格孢菌Alternaria sp.、极细链格孢霉Alternaria tenuissima、球毛壳菌Chaetomium globosum、链格孢属链格孢菌Alternaria alternata、白菜黑斑病菌Alternaria brassicae、白囊耙齿菌Irpex lacteu),其中叶中为3属6种,茎中为1属2种,链格孢属真菌为两者共同优势真菌。根据亲缘关系,这些内生真菌可分为3大类。总体来看,汤阴北艾内生真菌群落结构较为单一,种群丰富度较低,优势菌属为链格孢属。     

禾谷丝核菌拮抗真菌的鉴定及抗菌活性研究

利用从小麦茎叶组织中分离的内生真菌,进行平板对峙试验,从中筛选出2株对禾谷丝核菌有明显抑制效果的菌株(RF5和RF6)。采用改良的真菌基因组DNA提取方法,提取内生真菌RF5和RF6的基因组DNA,运用ITS序列通用引物(ITS4、ITS5)进行扩增,分别得到约600 bp的特异条带。对PCR产物进行测序,根据序列比对分析结果,将拮抗真菌RF5和RF6分别鉴定为:肉座菌(Hypoc-reales sp.)和杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。进一步研究这2株拮抗真菌的抗菌活性大小,结果显示,2株真菌对病原菌都能产生明显的抑菌圈,抑菌圈直径分别为23 mm和19 mm;其液体发酵产物对病原菌的生长也有显著抑制作用,抑制率分别为63.3%和60.8%。     

番荔枝科植物鹰爪内生真菌rDNA ITS-PCR扩增条件的优化

探索一种简单、快速的获得番荔枝科植物鹰爪内生真菌rDNA ITS目的片断的方法。采用改良的Rodrigues组织培养表面消毒技术和CTAB法提取植物样品总DNA,利用真核生物通用引物LH2/Sm73扩增rDNA ITS目的片段,正交法优选ITS-PCR扩增条件。PCR反应可同时获得两条600 bp和700 bp产物,分别为植物和内生真菌的rDNA ITS目的片断。改良的组织表面消毒技术可排除外源DNA污染。正交法可快速获得植物内生真菌目的片断。该法简单、快速,为番荔枝科植物内生真菌生物多样性研究提供分子生物学基础。     

珙桐产黄酮内生真菌的分离和鉴定

采用珙桐(Davidia involucrata Baill.)组织分离产活性物质的内生真菌,以金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌为测试细菌进行内生真菌代谢物对细菌的抑制实验,用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析内生真菌的活性物质成分。结果表明,从珙桐枝、叶中分离到126株内生真菌,其产物对3种细菌的抑菌率分别为65%、71%、25%,其中D37菌株对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。经HPLC分析证明,菌株D37的次生代谢产物中含有槲皮素、山奈酚2种黄酮类物质,每100 g干菌丝可产黄酮31.9 mg。根据菌株D37的形态学特征,结合核糖体基因居间序列(Internaltranscribed spacer,ITS)的分析结果,确定菌株D37为曲霉属,烟曲霉种(Aspergillus fumigatus)。从珙桐分离的产黄酮内生真菌D37可作为生产黄酮类药物的候选菌株,也为抗生素药物的筛选奠定了基础。     

具抑菌活性的诺丽内生真菌发酵条件的优化

为了研究发酵条件对诺丽内生真菌M2抑菌性的影响,笔者采用传统方法和ITS rDNA测序方法相结合,将本实验室筛选出的抑菌效果突出的诺丽内生真菌M2初步鉴定为棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）,在NCBI数据库中登录号为MK560191。通过单因素试验和正交设计对内生真菌M2进行发酵优化,筛选出最优发酵条件:（1）内生真菌M2优化后的培养基方案为200 g土豆煮沸30 min浸出液、葡萄糖20 g、硝酸钠5 g、磷酸二氢钾0.2 g、七水合硫酸镁0.2 g、1 000 mL双蒸水;（2）发酵条件为150 mL锥形瓶装液50 mL、温度25 ℃、培养基初始pH8、转速170 r·min?1。     

一株产巴卡亭Ⅲ红豆杉内生真菌的分离与鉴定

[目的]分离鉴定产巴卡亭Ⅲ红豆杉内生真菌。[方法]采用常规分离方法,从东北红豆杉（TaxuscuspidataSieb.etZucc.）树皮中分离并筛选内生真菌35株;通过高效液相色谱（HPLC）技术对菌株发酵物进行检测,并结合选择性离子质谱（MS）进行确认,从中获得1株能产紫杉醇前体物质巴卡亭Ⅲ的菌株Z-1;利用ITSrDNA通用引物对产紫杉烷类物质的内生真菌进行分子生物学鉴定,并结合菌落特征、孢子与分生孢子梗的形态特征进行分类鉴定。[结果]在未经诱导的情况下,Z-1产巴卡亭Ⅲ的量约为39μg/L;形态和分子鉴定分析判定Z-1属于木霉属（Trichoderma sp.）真菌。[结论]该研究可为植物内生真菌产紫杉烷类化合物的种类多样性和产紫杉烷类内生真菌的生物多样性提供依据。     

陕西蓝田核桃内生真菌多样性与时空分布

为了解陕西蓝田核桃(Juglans regia L.)内生真菌生态多样性与分布特性,采用组织分离法对不同季节的核桃树的不同组织部位进行内生真菌分离,以形态学和分子生物学相结合的方法进行鉴定。共分离获得核桃内生真菌676株,隶属于47个属,其中交链孢霉属(Alternaria)为优势类群,占菌株总数的19.23%;茎叶核菌属(Ectostroma)和葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)相对较丰富,分别占菌株总数的8.73%和6.21%。核桃不同部位内生真菌的多样性以茎部最高,1年生茎和2年生茎分别占菌株总数的24.56%和24.41%。不同季节的核桃内生真菌中,秋季(2013年10月)的多样性最高,分布于19个属,占菌株总数的34.91%。不同组织部位的核桃内生真菌多样性因季节变化而异。     

从分子系统发育探讨内生拟盘多毛孢与病原拟盘多毛孢的关系

收集马尾松、罗汉松、竹柏、山茶、茶和茶梅等植物的内生和病原拟盘多毛孢菌株,进行形态鉴定,根据rDNA ITS序列分析建立的系统发育树探讨病原与内生拟盘多毛孢之间的相互关系.结果表明,同一个种拟盘多毛孢不论是内生还是病原均聚在系统发育树的同一个分支,如罗氏拟盘多毛孢(Pestalotiopsis lawsoniae)既是马尾松枝条的内生真菌,又是马尾松针叶的病原真菌;卡斯特尼拟盘多毛孢(Pestalotiopsis karstenii)是山茶枝条的内生真菌,在山茶叶片上也是病原真菌;石楠拟盘多毛孢(Pestalotiopsis photiniae)是山茶和茶梅枝务的内生真菌,在马尾松针叶上也是病原真菌;茶拟盘多毛孢(Pestalotiopsis theae)是茶的病原真菌,在金花茶枝叶和罗汉松枝上是内生真菌.说明某些拟盘多毛孢在不同(或相同)的植物或器官中可以表现为内生状态或病原状态,内生拟盘多毛孢在一定条件下可以转变为病原拟盘多毛孢.本研究结果还支持拟盘多毛孢种一般对寄主植物没有专化性的结论.     

二甲四氯植物内生降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究

【目的】筛选可降解二甲四氯除草剂的内生真菌,研究内生真菌对二甲四氯的降解特性和途径,为除草剂污染的微生物治理提供理论依据。【方法】采用平板培养法从被二甲四氯严重污染的飞机草中筛选可降解二甲四氯除草剂的内生真菌;采用形态学方法观察内生真菌在培养基上的形态,结合分子生物学方法对内生真菌的ITS、TUB和LUS序列进行克隆和测序,对内生真菌进行鉴定;通过单因素法优化内生真菌在无机盐培养基中对二甲四氯的降解条件（温度、pH和营养源）;并采用液相色谱标准品比对、气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）和液相色谱—质谱联用仪（LC-MS）鉴定内生真菌在无机盐培养基中降解二甲四氯的产物。在30℃恒温培养箱中,分别添加内生真菌到不灭菌土壤和灭菌土壤中,同时设不添加内生真菌的土壤为对照组,测定二甲四氯在土壤中的降解速率。【结果】从飞机草中初筛发现1株内生真菌可很好地降解二甲四氯,编号为E68,结合形态学和基因序列分析可将E68鉴定为树状炭角菌（Xylaria arbuscula）。在二甲四氯初始浓度为50.0 mg/L条件下,E68降解二甲四氯的最优条件是pH 5.0、温度28℃和添加0.5%的葡萄糖,7 d后其降解率为97.03%。E68在无机盐培养基中降解二甲四氯的主要产物为4-氯-2-甲基苯。在含有2.5 mg/kg二甲四氯的土壤中添加E68,可明显提高二甲四氯在土壤中的降解率;与不添加E68的土壤相比,在不灭菌和灭菌土壤中分别接入E68后,二甲四氯的降解半衰期分别提高2.8和2.5倍。【结论】从飞机草中分离出的内生真菌E68在无机盐培养基和土壤中可有效降解二甲四氯,具有修复环境中二甲四氯污染的应用潜力。     

海南五指山野生美花兰根部内生真菌研究

美花兰(Cymbidium insigne)为大花蕙兰(Hybrid cymbidium)杂交育种的主要原生种之一,具有极为重要的保护和开发利用价值。内生真菌在兰科植物整个生活史中起着重要的作用。为了解美花兰内生真菌菌群种类,本研究采用组织分离法首次对海南岛五指山地区的野生美花兰根部的内生真菌进行分离,并根据所分离真菌的形态和ITS序列进行鉴定。共分离到内生真菌132株,确定为14属,隶属于半知菌类的Pestalotiopsis 5株,Aspergillus 16株,Penicillium 27株,Trichoderma 13株,Cylindrocarpon 14株,Curvularia 4株,Nigrospora 3株;Nodulisporium 11株,子囊菌门的Chaetomium 3株,Pezicula 1株,Neonectria 6株,Cryptosporiopsis 6株;担子菌门的Tulasnella 9株;Ascomycete sp.9株,因未见产孢暂不能确定其具体分类地位;5株菌(W2-2 1株、W2-6 2株及W6-5 2株)经诱导未见产孢,且其ITS序列与GeneBank中的序列相似性较低,可能是新的属或种。将所得ITS序列提交GeneBank,获得新的登陆号HQ889705-HQ889725。