苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry7Ba1溶解性分子改良

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）杀虫晶体蛋白Cry7Ba1需要在强碱性缓冲液中（pH12.5）才能溶解,而且只有溶解后才能对小菜蛾（Plutella xvlostella）表现出毒力,其LC50为1.33μg/mL。分别用Cry1Ac和Cry1C晶体蛋白的C-半段替换Cry7Ba1的C-半段,结果发现当Cry7Ba1的C-半段被替换后,重组晶体蛋白与Cry1Ac和Cry1C等其它晶体蛋白一样在弱碱性条件下（pH9.5）能有效溶解,而且重组晶体蛋白对小菜蛾的杀虫活性没有发生明显变化,其LC50分别为1.32和1.39μg/mL。结果还显示重组晶体蛋白不需要经过体外溶解就能对小菜蛾表现出杀虫活性。研究结果揭示Cry7Ba1晶体蛋白难溶的特性是由其C-半段结构决定的,通过改变其C-半段结构改善溶解性,为该晶体蛋白在害虫生物防治中的应用提供了可能。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白及其分子设计

Cry1Ac编码的杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bt）产生的多种杀虫晶体蛋白中对鳞翅目昆虫有很高毒性的蛋白。第一个Cry1Ac杀虫晶体蛋白最早在库斯塔克亚种HD73中以伴胞晶体形式分离获得,其编码区为3534bp,编码蛋白分子量为133kD,含1178个氨基酸,等电点为4.84。白此以来,Cry1Ac杀虫晶体蛋白结构、功能以及应用研究一直是Bt杀虫晶体蛋白研究的重要方向。本文介绍了苏云金芽孢杆菌中应用最广泛的Cry1Ac杀虫晶体蛋白家族的结构、功能及其基因分类,并进一步就基于苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因工程研究做了分析,提出了持续利用Bt Cry1Ac杀虫晶体蛋白的一些见解。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry218的克隆和表达

从对棉铃虫高毒力的苏云金芽胞杆菌２１８菌株中克隆到杀虫晶体蛋白基因ｃｒｙ２１８，限制性内切酶图谱表明该基因属于ｃｒｙ１Ａｃ基因。改造了两个质粒载体，并以此将ｃｒｙ２１８基因克隆到Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０３和苏云金芽胞杆菌无晶体突变株Ｂｔｉ７８／１１中，重组菌均表达１３０ｋＤ蛋白质，对小菜蛾的杀虫率在稀释１０００倍和３０００倍时可分别达到９０％以上和８０％以上。     

利用苏云金芽胞杆菌非芽胞特异性的启动子表达cry1Ac10和cry1C基因

利用重叠延伸ＰＣＲ技术,将苏云金芽胞特异性的ｃｒｙ３Ａ基因的启动子替换ｃｒｙ１Ａｃ１０和ｃｒｙ１Ｃ基因的启动子序列,并用ｃｒｙ１Ａｃ１０基因的终止序列,替换ｃｒｙ１Ｃ基因终止密友子下淳的序列,得到改造的ｃｒｙ１Ａｃ１０和ｃｒｙ１Ｃ基因,改免与其内源杀虫晶体蛋白基因竞争转录因子（σ因子）从而提高杀虫晶体蛋白的表达量,为构建高效杀虫工程菌提供了有效的基因。     

苏云金芽胞杆菌Bt9875杀虫晶体蛋白可诱导Caspase和Bcl-2家族参与调控HL-60细胞凋亡

研究Caspase家族与Bcl-2家族参与调控苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Bt9875杀虫晶体蛋白对人急性髓细胞性白血病细胞HL-60的影响.本实验采用MTT法检测了杀虫晶体蛋白诱导HL-60细胞凋亡后的Caspase家族的活性和Caspase凋亡酶抑制剂对杀虫晶体蛋白诱导HL-60细胞凋亡的影响;采用Western blot检测了杀虫晶体蛋白诱导多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)降解、Bcl-2/Bax调控和细胞色素C的释放.研究结果表明,杀虫晶体蛋白作用HL-60细胞后,激活了Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9,在48 h内Caspase家族抑制剂(Z-VAD-FMK)、Caspase-3抑制剂(z-DEVD-FMK)和Caspase-9抑制剂(Z-LEHD-FMK)均可显著抑制杀虫晶体蛋白诱导的细胞凋亡;杀虫晶体蛋白可明显上调促凋亡蛋白Bax的表达,同时下调抗凋亡蛋白BCl-2的表达,并观察到胞浆中细胞色素C的释放.初步证明了Bt9875杀虫晶体蛋白诱导的HL-60细胞凋亡是由Caspase家族和Bcl-2家族共同调控的,线粒体途径在诱导细胞凋亡过程中起着重要作用.     

苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫生物测定方法的建立和高毒力菌株的筛选

本研究建立了一套利用苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫的生物测定方法。通过该方法从本实验室收集保藏的苏云金芽胞杆菌菌株中筛选出了对植物寄生线虫有毒杀作用的菌株11株。通过复筛确定了10个菌株的伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫有活性；SDS-PAGE显示这些菌株的伴胞晶体蛋白组成具有特异性和多样性。其中菌株YBT-021的杀线虫其半致死浓度（LC50）分别为：北方根结线虫(Meloidogyne hapla) 35.62μg/mL，苎麻短体线虫(Pratylenchus scribneri) 75.65μg/mL，苎麻矮化线虫（Tylenchornchus sp.）94.31μg/mL，甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor) 215.21μg/mL。     

苏云金芽胞杆菌WZ-9菌株对马铃薯瓢虫的毒力及其杀虫基因的研究

苏云金芽胞杆菌(Bacillus tbutingiensis)WZ-9是从土壤中分离的对马铃薯瓢虫(Henosepilachna vigintioctomaculata)的幼虫有特异杀虫活性的新菌株.实验对WZ-9菌株的形态特征、生长特性、生物活性、基因型和蛋白型等进行了研究.结果表明,WZ-9菌株可产生菱形伴胞晶体,SDS-PAGE检测表达的主要蛋白条带分子量约为130 Kd;液体培养的生长周期是24 h,随菌株的生长培养基Ph发生较大波动,在潜伏期和稳定期,Ph变化较小,在对数生长期Ph呈先迅速下降、再缓慢回升的变化趋势;生物活性测定表明,WZ-9菌对马铃薯瓢虫2龄幼虫72 h校正死亡率达100%,LC50为2.95×107细胞/Ml;基因型鉴定表明,WZ-9菌株含有cry7基因,利用PCR扩增方法获得了1条总长为3 781 bp基因序列,其中包含了1个3 414 bp开放读码框,其编码蛋白由1138个氨基酸残基组成,与Cry7Ab2具有99.65%序列同源性,存在4个氨基酸差异,亲缘关系最近,被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry7Ab3(登录号为BI1015188).     

苏云金芽胞杆菌转座子整合载体的构建

利用苏云金芽胞杆菌转座子Ｔｎ４４３０的转座机制构建了可用于将外源基因整合到染色体的整合载体系列。将Ｔｎ４４３０的解离酶基因（ｔｎｐＩ）和转座酶基因（ｔｎｐＡ）移至两个倒转重复的反向重复序列之外,并用多克隆位点取代;将这种转移结构置入不稳定的穿梭载体ｐＢＭＢ６２２Ｎ中,获得ｐＢＭＢ－Ｆ７和ｐＢＭＢ－Ｒ１４。当红霉素抗性基因插入其中的多克隆位点后,在ＢＭＢ１７１ ｔｎｐＡ基因会随着质粒的消除而消失。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Aa和Cry3A结构域编码区的融合

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)毒素蛋白由3个不连续的结构域（domains)组成，其中结构域I为膜跨越区，与膜孔道形成有关，结构域Ⅱ，Ⅲ与受体结合有关。利用基因重组技术以鳞翅目昆虫具专一活性的毒素蛋白Cry1Aa与专一性有关的结构域编码区与对鞘翅目昆虫具专一活性的毒素蛋白Cry3A编码基因融合，构建成融合表达载体，为进一步构建Bt工程菌和Bt转基因植物奠定基础。     

Mineralization of the Bacillus thuringiensis Cry1Ac endotoxin in soil

Although a number of studies have been done describing the fate of Bacillus thuringiensis insecticidal endotoxins in soil, there is conflicting information on the persistence of this class of insecticidal toxins. This is partly due to methodological limitations in many of the previous studies. In the experiments reported here, 14C-labeled B. thuringiensis Cry1Ac endotoxin was used to study its mineralization in soil incubated under controlled conditions. Fifty-nine percent of the radiolabeled Cry1Ac was recovered as 14CO2 at the end of the 20 day incubation period. The addition of 4.5% corn residues stimulated mineralization of [14C]Cry1Ac toxin, and mineralization of glucose was 3.6 times faster than that of the Cry1Ac toxin, indicating that the soil was microbiologically and metabolically active. Because only low mineralization (approximately 6%) of the radiolabeled toxin was observed in autoclaved soil, the current findings indicate that microbial processes play a major role in the dissipation of the Cry1Ac endotoxin in soil. The results of this study suggest that there may be limited risk of the bioaccumulation of Cry1Ac in soil due to the eventual release of this insecticidal toxin by Bt-protected crops.     

苏云金芽孢杆菌4.0718菌株晶体毒素性质的研究

以苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）4．0718菌株伴孢晶体65kD原毒素为材料，比较了几种染色-脱色方法对电洗脱回收蛋白的影响。蛋白纯化的步骤包括SDS-PAGE分离、采用自制蛋白回收装置电洗脱回收杀虫晶体蛋白及抗胰蛋白酶核心多肽、超滤法脱盐、冷丙酮沉淀法除去考马斯亮蓝及SDS。经SDS—PAGE检测，呈现出均一的蛋白带，回收蛋白达到了电泳纯。以双向凝胶电泳（2-DE）技术分析了苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD—1和4．0718菌株伴孢晶体内的蛋白质组分。结果表明，两者相互匹配的蛋白点有54个，HD—1菌株的130kD亚基有2个点，其等电点在5．25～5．75之间，65kD亚基在等电点3．4～8．3之间具有广泛的分布，130与65kD之间的亚基的等电点集中在3．5～4．2之间，65kD以下亚基的等电点集中在3．5～6．2之间；4．0718菌株的130kD亚基仅有1个点，65kD亚基的蛋白点比HD-1菌株更多，130与65kD之间的亚基、65kD以下的亚基蛋白点均比HD-1菌株多且等电点分布范围更广。     

苏云金杆菌Cry2Ab可溶蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

苏云金杆菌Cry2Ab蛋白是一类对鳞翅目昆虫有特异性毒性作用的毒素蛋白,已广泛应用于针对鳞翅目害虫的防治之中。依据苏云金杆菌cry2Ab基因序列设计一对全长引物,从苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)WB9菌株总DNA中克隆出cry2Ab基因全序列,构建Cry2Ab-PK表达载体,将获得的Cry2Ab-PK阳性克隆进行原核诱导表达,获得约90kD的Cry2Ab-GST融合蛋白,经批量纯化并切除GST标签后获得可溶Cry2Ab蛋白,约65kD。利用纯化Cry2Ab可溶蛋白免疫新西兰雄性大白兔(Oryctolagus cuniculus),制备Cry2Ab兔源多克隆抗血清,通过间接ELISA法测定Cry2Ab抗血清效价超过1:150000。Western blot测定结果表明,制备的Cry2Ab兔源抗血清能特异性识别Cry2Aa及Cry2Ab抗原蛋白,不能识别Cry1Ab及Cry3Aa抗原蛋白。研究结果对深入研究Cry2A毒素蛋白作用机理及毒素与受体间互作关系提供了技术支持。     

Enterotoxigenicity and cytotoxicity of Bacillus thuringiensis strains and development of a process for Cry1Ac production

Bacillus thuringiensis is indistinguishable from Bacillus cereus except for the production of insecticidal crystal proteins (ICPs). B. thuringiensis strains may show enterotoxin profiles and toxin levels similar to those of B. cereus strains isolated from food-poisoning cases. It is important for the food industry and farmers to consider that with the application of B. thuringiensis strains to crops, their spores may be introduced into the human food chain. In this study, 59 B. thuringiensis strains were assayed for their hemolysin BL (HBL) using a BCET-RPLA kit and their cytotoxicity to Chinese hamster ovary (CHO) cells. The enterotoxin titer was as high as that of B. cereus diarrheal-type strain ATCC 49064. In an attempt to obtain a food safety strain for bioinsecticide use, in this study, a 3.5-kb cry1Ac DNA fragment was amplified with PCR from the total DNA of B. thuringiensis subsp. kurstaki CCRC 11502 and cloned into the Bacillus expression vector pHY300PLK. The alpha-amylase promoter, amyE, was then introduced into the promoter region and, afterward, the recombinant plasmid pHYe1Ac35 was introduced into a non-enterotoxigenic and non-cytotoxic B. thuringiensis subsp. kurstaki Tt14 strain. The transformant, without any detectable enterotoxigenicity or cytotoxicity, produced Cry1Ac toxin properly, and its insecticidal activity against Trichoplusia ni larvae was found to be satisfactory.     

鉴别苏云金芽孢杆菌生产菌株MZ1的溶原性噬菌体

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thurillgicnsis，Bt）作为不污染环境而又高效的生物杀虫剂已广泛地应用。可是，在83％的Bt菌株中都能分离到相应的溶原性噬菌体，在发酵生产中由其引起的发酵倒罐率轻者为15％-30％，重者达到50％-80％，甚至会导致工业的破产，因此溶原性噬菌体已成为发酵工业的一大危害。本研究采用溶原性噬菌体的指示菌、直接电镜观察法和噬菌体DNA等综合进行检测，证明了该菌株属于溶原菌。此研究既能为生产上防治溶原性噬菌体提供理论依据，又能为后续阶段研究其溶原性爆发规律及其分子生物学准备了生物实验材料。     

苏云金芽孢杆菌cry1Aa14基因的分离、克隆及其表达

Bt25是中国自行分离的对小菜蛾(Plutella xylotella)具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),经PCR-RFLP鉴定含有cry1Aa基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法,设计1对特异引物,以Bt25质粒DNA为模板扩增cry1Aa全长基因。序列测定结果表明,该基因编码区为3552bp,编码1183个氨基酸,分子量为133．7kD,pI4．755。该基因序列已在GenBank注册,登记号为AY197341,并获得正式命名cry1Aa14。在氨基酸序列918～1180间,和已知的11种cry1Aa存在22-23个氨基酸的差异(其中1094～1097的4个氨基酸无对应序列),而这段区域和Cry1Ab氨基酸序列的对应区域无差异。cry1Aa14全长基因插入Bt表达载体,获得了重组表达质粒pBYB1,转化Bt无晶体突变株HD73cry-,经过抗性筛选、DNA酶切分析和PCR检测,证实转化成功。SDS-PAGE分析表明,该基因在上述受体中能正常表达133kD蛋白。杀虫生物测定结果表明,cry1Aa14表达产物对小菜蛾幼虫具有显著的毒杀作用,与cry1Aa12进行比较,毒力无明显差异。这种单基因菌株的发现及其基因的获得,为害虫抗性研究和高效工程菌的构建提供了重要实验材料。     

苏云金芽胞杆菌新菌株S184 cry1Ab基因的克隆

通过对ＧｅｎＢａｎｋ中ｃｒｙ１类基因序列的保守区进行分析,设计一对针对其保守区的引物Ｙ５－１（ＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧ）和Ｙ３－１（ＧＣＴＧＴＧＡＣＡＣ ＧＡＡＧＧＡＴＡＴＡＧＣＣＡＣ）,对苏云金芽胞杆菌（Ｂａｘｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ,Ｂｔ）新菌株Ｓ１８４质粒ＤＮＡ进行扩增,得到一大小为１．５ｋｂ的ＤＮＡ片段,序列分析显示该片段与ｃｒｙ１因基因高度同源。以此片段为