RACE法扩增梅花鹿β-防御素-1(siBD-1)全长cDNA

为了获得梅花鹿β-防御素-1（sika deer β-defensin-1,siBD-1）cDNA全序列,本试验以梅花鹿舌黏膜组织内提取的总RNA为模板,根据前期已获得的siBD-1 cDNA的已知部分序列设计引物,采用5'-RACE和3'-RACE技术分别扩增5'-和3'-末端序列,将此扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明,成功克隆出长度约为172和299 bp的siBD-1 cDNA 5'-和3'-末端序列,从而得到418 bp的siBD-1 cDNA全序列（GenBank登录号：HM588696.1）,其中包含89 bp 5'-非翻译区（UTR）、192 bp的开放阅读框（ORF）、终止密码子TAA、118 bp的3'-UTR和Poly（A）16。同源性比对结果显示,siBD-1 cDNA与水牛的肠防御素（BEBD）同源性最高,为90.6%,与牛（EBD、LAP、TAP、BNBD-4）、山羊（GBD-1、GBD-2）、驯鹿（reBD-1）、绵羊（sBD-1、sBD-2）和骆驼（caBD-1）的防御素cDNA的同源性较高,分别为83.2%、83.1%、87.3%、87.0%、87.5%、87.5%、84.4%、79.9%、77.1%和70.5%;与马（hoBD-1）和猪（pBD-1）的同源性较低,为60.3%和72.4%;而与人（hBD-2）的同源性最低,为16.0%。siBD-1成熟肽由38个氨基酸残基组成,其中包含9个带正电荷的氨基酸残基。     

佳米驴β防御素aBD-1基因克隆及序列分析

为获得佳米驴β防御素-1(aBD-1)的全长cDNA序列,为开发其药用功能积累资料。从佳米驴舌黏膜上皮组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出aBD-1(ass-βdefensin-1)cDNA的中间片段后,再采用RACE法,扩增佳米驴β防御素aBD-1的cDNA全序列。aBD-1 cDNA全序列长为360 bp,其中包含192 bp的开放阅读框,37 bp的5′非翻译区(5′UTR),102 bp的3′非翻译区(3′UTR)以及poly(A)26。在GenBank上注册号为EU265778,测序结果和序列生物信息学分析结果表明,其与马β防御素eBD-1、牛的β防御素TAP、绵羊的β防御素sBD-1、猪的β防御素pBD-1和人的β防御素hBD-2的同源性分别为92%、68%、75%、75%和68%。aBD-1全长cDNA是β防御素家族中的一个新基因。     

蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素(sBD-1)的序列分析及组织表达

从蒙古绵羊输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA,根据GenBank中羊的β-防御素的cDNA序列设计合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了301bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析,确认该PCR产物为β-防御素。通过相同的RT-PCR反应体系和条件后,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,以β-actin为参照,根据PCR产物的亮度推断不同组织中β-防御素的表达量。结果,蒙古绵羊雌性生殖道上皮各组织均有β-防御素表达,说明β-防御素在蒙古绵羊雌性生殖道的先天免疫中起重要作用。β-防御素的表达量在雌性生殖道各组织内不同,提示雌性生殖道各组织的防御功能强度不同。     

RACE法扩增梅花鹿β-防御素-1(siBD-1)全长cDNA

为了获得梅花鹿β-防御素-1(sika deerβ-defensin-1,siBD-1)cDNA全序列,本试验以梅花鹿舌黏膜组织内提取的总RNA为模板,根据前期已获得的siBD-1cDNA的已知部分序列设计引物,采用5′-RACE和3′-RACE技术分别扩增5′-和3′-末端序列,将此扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明,成功克隆出长度约为172和299bp的siBD-1cDNA 5′-和3′-末端序列,从而得到418bp的siBD-1cDNA全序列(GenBank登录号:HM588696.1),其中包含89bp 5′-非翻译区(UTR)、192bp的开放阅读框(ORF)、终止密码子TAA、118bp的3′-UTR和Poly(A)16。同源性比对结果显示,siBD-1cDNA与水牛的肠防御素(BEBD)同源性最高,为90.6%,与牛(EBD、LAP、TAP、BNBD-4)、山羊(GBD-1、GBD-2)、驯鹿(reBD-1)、绵羊(sBD-1、sBD-2)和骆驼(caBD-1)的防御素cDNA的同源性较高,分别为83.2%、83.1%、87.3%、87.0%、87.5%、87.5%、84.4%、79.9%、77.1%和70.5%;与马(hoBD-1)和猪(pBD-1)的同源性较低,为60.3%和72.4%;而与人(hBD-2)的同源性最低,为16.0%。siBD-1成熟肽由38个氨基酸残基组成,其中包含9个带正电荷的氨基酸残基。     

蒙古绵羊β-防御素-1全长cDNA序列的扩增与分析

本研究以蒙古绵羊瘤胃为材料,提取瘤胃上皮组织总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出蒙古绵羊β-防御素-1(mgSBD-1)基因的核心片段序列,再应用5ˊ和3ˊ快速扩增cDNA末端(RACE)方法扩增蒙古绵羊β-御素-1基因的cDNA末端序列,最终获得mgSBD-1基因的全长cDNA序列.结果显示,该全长cDNA序列为325个碱基[不含poly(A)],5ˊ非翻译区为31个碱基,编码区(192个碱基)可编码64个氨基酸,3ˊ非翻译区为99个碱基[不含poly(A)].     

驯鹿β-防御素reBD-1 cDNA的克隆及序列分析

从驯鹿舌黏膜上皮组织中提取总RNA，采用RT—PCR技术扩增出reBD-1的cDNA，并重组到pBlueselect T载体，经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定，证实所克隆的reBD-1的cDNA为β-防御素，因为该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框（ORF），该ORF编码64个氨基酸残基的前原防御素，该前原防御素含有伊防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。驯鹿β-防御素属首次发现，为更好地了解驯鹿黏膜防御机制有很大的帮助。     

洼地绵羊防御素sBD-1基因克隆、序列分析及SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法的建立与应用

根据GenBank上登录的绵羊防御素基因序列,经多重比较后,设计1对引物,从洼地绵羊舌上皮组织中扩增到防御素sBD-1基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序.结果表明,扩增基因全长215 bp,编码64个氨基酸.基因进化树分析表明,与蒙古绵羊sBD-1基因有较近的亲缘关系,核苷酸同源性为98.5%;而与黄牛的亲缘关系最远,核苷酸同源性84.6%.氨基酸序列分析表明,序列内无信号肽区域,具有3个潜在的抗原表位.以pMD18-T/sBD-1质粒为模板建立了sBD-1基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,核酸电泳、扩增动力学曲线、溶解曲线及重复性试验表明,检测方法具有良好的稳定性和特异性,得到的回归方程(R2=0.998)表明PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在良好的线性关系,从舌、盲肠及输卵管等组织中可以进行有效的检测,检测灵敏度为83.9 copies/μL.该方法为进一步研究防御素sBD-1基因在洼地绵羊抗逆性过程中的作用奠定了基础.     

骆驼β-防御素caBD-1全长cDNA的扩增

获得全长cDNA 序列是研究基因结构、基因表达和基因功能的前提.我们根据已获得的骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的已知序列设计一条上游引物,反转录引物中的部分序列即3′末端序列.另外,采用反向嵌套PCR RACE法,根据caBD-1 cDNA的已知序列,设计一条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录成的cDNA 进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功的克隆了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的5′末端序列.本研究扩增出的caBD-1 cDNA序列全322 bp,其中包含一个由192 bp组成的开放读码框(ORF),该ORF编码64个氨基酸残基的前原caBD-1肽.     

原位杂交技术检测蒙古绵羊胎儿β-防御素的表达

通过地高辛标记的原位杂交方法来检测β-防御素(sBD-2) mRNA在蒙古绵羊胎儿体内的表达。取4月龄的蒙古绵羊胎儿的肺、胃、肠、子宫、舌、心脏各1 cm3来做原位杂交。结果表明,sBD-2 mRNA在蒙古绵羊胎儿的肺、胃、肠、子宫、舌、心脏为代表的呼吸系统、消化系统、 吸收系统、生殖系统、肌组织中均有分布。因此,sBD-2作为一种广谱高效抗菌肽,广泛分布于胎儿体内。     

雌性骆驼生殖组织β-防御素-1基因的克隆及其组织表达量的检测

从雌性骆驼输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA，根据已发表的骆驼β-防御素-1基因的cDNA序列设计合成引物，采用RT—PCR扩增出了骆驼β-防御素-1基因；将扩增产物克隆于pBlueselect T载体后进行了序列分析。以伊肌动蛋白（pactin）基因作为内参，对扩增的β-防御素-1基因进行琼脂糖凝胶电泳后，应用凝胶成像分析系统，推断出了不同组织中β-防御素-1基因的表达量。结果，从雌性骆驼生殖各组织上皮均获得了203bp的β-防御素-1基因的扩增片段，且β-防御素-1基因在雌性骆驼生殖道各组织内的表达量不同。结果表明，β-防御素-1在雌性骆驼生殖组织的先天免疫中起重要作用。     

绵羊防御素(sBD-1)cDNA的克隆及其植物中表达载体的构建

为了获得在植物中表达的绵羊防御素 ,从绵羊舌表皮组织中分离提取总RNA ,经逆转录PCR (RT PCR)扩增出绵羊防御素sBD 1全长cDNA ,回收扩增产物连接到克隆载体 ,测序分析表明该cDNA为 2 1 5bp ,与报道序列完全一致。将该序列替换插入质粒PBI1 2 1中的GUS编码序列 ,构建植物表达载体PBIC 35SsBD1 ,为进一步进行转基因植物和绵羊防御素功能的研究奠定了基础。     

蒙古绵羊卵丘细胞ghrelin部分序列的鉴定

为了研究生长激素释放多肽(ghrelin)mRNA是否在蒙古绵羊卵丘细胞中表达,试验根据Gen-Bank中报道的绵羊ghrelin序列设计1对特异性引物,以蒙古绵羊卵丘细胞中的RNA为模板,采用实时定量RT-PCR技术扩增蒙古绵羊ghrelin的cDNA,并进行测序分析。结果表明:扩增得到的蒙古绵羊ghrelin cDNA为ghrelin的部分序列,将测序结果与已发表的绵羊ghrelin序列进行比对发现,233个碱基中有1个碱基的差异,该差异不影响翻译后多肽的序列;该cDNA片段包含长度为231 bp的开放读码框(ORF),编码77个氨基酸的绵羊ghrelin前原肽。     

驯鹿β-防御素-1 cDNA 3’末端的克隆及序列分析

为进一步研究驯鹿伊防御素-1（reBD-1）基因的分子结构，利用已克隆出的reBD-1部分片段，设计了1条特异性上游引物，并以反转录引物中的部分序列即3sites Adaptor Primer作为下游引物，采用3’RACE技术成功克隆了reBD-1 cDNA的3’末端序列。通过与已知reBD-1片段拼接，得到了192bp的完整开放读码框（ORF）、终止密码子TAA、118bp的3’非翻译区（3’UTR）以及poly（A）1S,其中ORF编码具有64个氨基酸残基的reBD-1前原肽。     

骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因全序列RACE扩增方法的建立

为获得骆驼β-防御素基因（caBD-1cDNA）的全长序列，采用锚定PCRRACE技术，根据已获得的骆驼伊防御素基因的部分已知序列，设计了1条特异性引物作为上游引物，将反转录引物中的部分序列即3’接合器引物作为下游引物，成功地克隆了caBD-1cDNA的3’末端序列；采用反向嵌套PCRRACE技术，根据已获得的骆驼β-防御素cDNA的部分序列，设计了1条5’末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物，首先进行反转录（RT），然后将mRNA反转录的cDNA进行环化，最后进行反向嵌套巢式PCR，成功地克隆了骆驼伊防御素caBD-1cDNA的5’末端序列。结果显示，获得了骆驼伊防御素caBD-1cDNA基因的全序列。证实，RACE技术用于防御素基因的扩增是可行的。     

骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的克隆及序列分析

β防御素是一类富含半胱氨酸的抗微生物多肽，主要表达在哺乳动物黏膜上皮内。我们发现了一种新的β-防御素-骆驼防β-御素-1(caBD-1)。从骆驼舌黏膜上皮组织中提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增出caBD-1的cDNA，并重组到pBlueselect T载体，经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定，证实所克隆的caBD-1的cDNA为β-防御素，因为该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框(ORF)，该ORF编码64个氨基酸残基的前原防御素，该前原防御素含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氮酸残基。骆驼β-防御素的发现对我们更好地理解骆驼黏膜防御机制有很大帮助。     

蒙古绵羊ghrelin cDNA的克隆及序列分析

根据GenBank中报道的绵羊ghrelin序列设计一对特异性引物，以蒙古绵羊真胃组织中提取的总RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增出蒙古绵羊ghrelin的cDNA，并克隆到pTZ19载体中，经限制性内切酶谱和DNA序列测定，证实所克隆的蒙古绵羊ghrelin的cDNA为ghrelin的部分序列，因为用NCBI网站上的BLAST功能将测序结果同已发表绵羊ghrelin序列进行对比，205个碱基中仅有1个碱基的差异，该差异不影响翻译后多肽的序列。该段cDNA包含由168个碱基组成的开放读码框（ORF），该ORF编码56个氨基酸残基的前原蒙古绵羊ghrelin。对蒙古绵羊ghrelin的研究将有助于进一步揭示其生理和病理功能，对反刍动物多种疾病过程的认识及防治策略具有深远意义。     

奶牛乳房炎抗性基因TAP cDNA克隆及序列分析

采用RT-PCR方法从奶牛乳腺组织中扩增气管抗菌肽(TAP)基因,重组到pMD19-T Simple载体中,并进行序列分析。序列分析结果显示,克隆的TAP基因包含完整的开放阅读框(ORF) 195 bp,与牛TAP基因同源性达93.8%;该ORF编码的64个氨基酸,含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。TAP基因cDNA完整开放阅读框的克隆,为进一步开发应用重组牛β-防御素奠定了基础。     

奶牛乳房炎抗性基因TAP cDNA克隆及序列分析

采用RT-PCR方法从奶牛乳腺组织中扩增气管抗菌肽(TAP)基因,重组到pMD19-T Simple载体中,并进行序列分析。序列分析结果显示,克隆的TAP基因包含完整的开放阅读框(ORF)195 bp,与牛TAP基因同源性达93.8%;该ORF编码的64个氨基酸,含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。TAP基因cDNA完整开放阅读框的克隆,为进一步开发应用重组牛β-防御素奠定了基础。     

蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平实时定量PCR方法的建立

为了利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术对蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素基因表达水平进行相对定量测定,建立蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平的实时荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中羊β-防御素基因序列设计合成引物,进行实时荧光定量PCR,同时以β-Actin为内参基因对β-防御素基因进行均一化处理,利用荧光阈值(Ct值)计算β-防御素基因的相对表达量.结果表明:扩增产物为β-防御素;利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素基因表达水平相对含量.     

鸡β-防御素Gal-1 cDNA的克隆及序列分析

利用细胞总RNA提取试剂盒,从1月龄SPF鸡白细胞中分离提取总RNA,经过反转录PCR(RT-PCR)扩增出鸡β-防御素(Gal-1)cDNA片段。PCR产物经凝胶回收纯化后与pMD18-T载体连接,转化感受态JM109细胞,在含X-gal、IPTG的LB平板上筛选阳性克隆,经菌落PCR与质粒限制性酶切鉴定后,对目的片段进行测序。结果表明RT-PCR扩增出的cDNA片段ORF大小为198bp,用Blast程序进行检索比较表明该序列与Genbank中发表的鸡Gal-1 cDNA编码区序列同源性高达99.5%。该cDNA序列编码65个氨基酸,包括信号肽、前片段和成熟肽,成熟肽由40个氨基酸残基组成。