天蓝色链霉菌M145中bldA依赖性突变的遗传定位与分析

bldA编码天蓝色链霉菌中识别UUA密码的tRNA,大部分菌株的生长不需要bldA功能。M145菌株发生了突变,使bldA成为必需基因。本研究以M145和1258等菌株为亲本,通过3轮杂交筛选构建了菌株LY3,作为遗传定位bldA依赖性(bldA-dependent,bad)突变的亲本之一。用LY3与1258杂交,筛选了217个重组子并鉴定其基因型。对217个重组子的基因型进行遗传分析,将bad突变定位于天蓝色链霉菌染色体SCO3934与SCO4659基因之间的758 kb区域。     

波卓霉素生物合成基因簇的异源表达及产量提高

波卓霉素是从波卓链霉菌(Streptomyces bottropensis)中分离得到的,具有抗革兰氏阳性菌及支原体的生物活性,尤其重要的是对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和抗万古霉素肠球菌有抑菌活性。试验通过构建基因组文库,PCR筛选获得包含完整波卓霉素合成基因簇的柯斯质粒4E11,通过接合转移的方法把4E11转化至天蓝色链霉菌M145中,对获得的异源表达株M145/4E11进行发酵,通过提取纯化和HPLC-MS检测,表明M145/4E11发酵液中产生了波卓霉素;试验并通过Red/ET重组系统,以红霉素启动子(ermE*P1)替换了波卓霉素生物合成簇抗性基因btmA和前提肽合成基因btmD的启动子,成功实现异源表达株M145/4E11波卓霉素的产量提高。     

一个链霉菌中微型转座子系统的构建

针对链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷,构建了一个链霉菌中的微型转座子质粒pHL265,它携带的转座酶基因tnpA在转座子mini-Tn4560A外部,降低了发生二次转座的可能性,并带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,可通过接合转移的方式将其从大肠杆菌导入到链霉菌中.利用该转座子系统转座筛选得到天蓝色链霉菌M145的约1 000株转座突变株.选取其中的8株,经Southern杂交验证可知,该转座子的转座基本具有随机性,并在宿主DNA中稳定存在.此系统为链霉菌功能基因组的研究提供了新的技术手段.     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 nsdA_(mgh)基因的验证

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的一株拮抗菌。该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)等多种重要的植物病原真菌都具有较强的抑制作用。nsdA(negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是从天蓝色链霉菌中发现的与抗生素合成相关的负调控基因。根据天蓝色链霉菌A3(2)的序列设计引物,PCR扩增出Men-myco-93-63nsdAmgh基因,经斑点杂交法验证,nsdAmgh确实在该生防菌中存在。该基因的发现有助于进一步了解该生防菌产生抗生素调节的分子机制,也为抗生素高产菌株的获得提供了新的靶标。     

犹他游动放线菌SW1311中阿库来菌素A酰基酶在棘白菌素类抗真菌药物合成中的应用（英文）

棘白菌素类抗真菌药物米卡芬净和阿尼芬净的合成工艺中包括一个关键步骤:水解除去FR901379分子和棘白菌素B(echinocandin B,ECB)分子的脂肪酸侧链,形成环状的6元多肽核心。FR901379和ECB的水解可以分别被FR901379酰基酶和阿库来菌素A酰基酶(aculeacin A acylase,AAC)催化,因此,FR901379酰基酶和AAC的发掘、表征和生产在米卡芬净和阿尼芬净的工业生产上具有重要的应用价值。本研究首先筛选到了犹他游动放线菌SW1311,发现该菌株发酵液具有酰基酶活性,并摸索了不同发酵条件对酰基酶活性的影响。然后将犹他游动放线菌SW1311中的AAC基因克隆到改造过的质粒载体p IJ8660中,并将该质粒转化到天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)中对AAC基因进行高表达,得到重组菌株sSCO-AAC。最后将sSCO-AAC生产的AAC活性和所需培养时间与犹他游动放线菌SW1311进行比较,表征了sSCO-AAC的发酵液水解FR901379的反应。结果表明,犹他游动放线菌SW1311中的酰基酶具有水解FR901379和青霉素V的酰基活性。用重组菌株sSCO-AAC生产的AAC活性比犹他游动放线菌SW1311的高4.6倍,且该重组菌株所需的培养时间比犹他游动放线菌SW1311缩短了30%。该结果不仅将ACC的应用范围从阿尼芬净合成拓宽到了米卡芬净合成,而且还揭示出天蓝色链霉菌A3(2)可以作为一个良好的AAC表达菌株。本研究对阿尼芬净和米卡芬净的工业化生产具有潜在的应用价值。     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中3个调控基因的检测

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63及其发酵液对多种重要植物病原菌均表现出很强的抑制作用,在植物病害生物防治方面有很大的应用潜力。根据天蓝色链霉菌A3(2)调控基因tcrA、sarA和scrX序列设计引物,扩增Men-myco-93-63基因组DNA,分别获得705bp、1 472bp和473bp的片段,经测序和比对,上述片段与天蓝色链霉菌A3(2)的tcrA、sarA和scrX基因在核苷酸序列和氨基酸序列上同源性均为99%,因此,推测玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中很可能含有这些调控基因。Men-myco-93-63中这3个调控基因的初步检测为玫瑰黄链霉菌功能基因的获得、菌株的遗传改良和代谢调控途径的研究提供了重要依据。     

强启动子A4促进黄色链霉菌高产放线菌素D

【背景】放线菌素D是神经母细胞瘤、绒毛膜上皮癌和横纹肌肉瘤等恶性肿瘤的特效药,黄色链霉菌TRM 45540是一株产放线菌素D的高产菌株。【目的】通过导入强启动子A4,以期提高黄色链霉菌合成放线菌素D的产量。【方法】将强启动子A4整合到质粒pSET152中,转化到大肠杆菌,通过大肠杆菌与黄色链霉菌TRM 45540的接合转移,将启动子A4片段插入黄色链霉菌中,采用高效液相色谱法对接合子TRM 45540::pYS001和野生菌株TRM 45540进行发酵产物中放线菌素D的比较分析。【结果】启动子A4片段成功插入到黄色链霉菌TRM 45540::pYS001,与原始菌株相比,在相同发酵条件下放线菌素D的产量提高了26. 85%,产量达821. 8 mg/L。【结论】强启动子A4能够促进黄色链霉菌高产放线菌素D。     

水稻稻瘟病拮抗链霉菌的筛选

为从自然生态环境中寻找对水稻稻瘟病菌有拮抗作用的链霉菌,采用平板对峙法,从土壤中筛选出4株对稻瘟病菌有明显抑制作用的链霉菌St-10、St-85、St-107、St-120,通过测定拮抗带宽度并对拮抗菌株发酵液拮抗性的测定,最终得到1株高拮抗活性物质菌株St-10,抑菌率为52.0%。但试验分离到的菌株能否用于田间防治水稻稻瘟病,还需要进一步研究。     

从红曲粉中分离筛选高产红色素的菌株

为分离筛选出产红色素能力强的菌株,采用不同培养基,以稀释倒平板法及平板划线法从红曲粉中分离纯化,再以红色素含量为指标,进行摇瓶发酵试验,优选出产红色素的菌株。结果表明:经分离纯化获得3株产红色素霉菌M1、M2和M3;发酵试验表明,M1菌株在黄豆芽汁发酵液和M3菌株在马铃薯发酵液中产红色素能力都较强,经形态学鉴定证实M1和M3菌株是红曲霉菌,且对酸和乙醇有一定的耐受性。     

变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建

以变铅青链霉菌TK24为出发菌株,依次敲除钙依赖抗生素(CDA)、放线紫红素(ACT)和十一烷基灵菌红素(RED)这3个内源抗生素的生物合成基因簇,同时在钙依赖抗生素基因簇原位整合了来自棒状链霉菌的全局性调控基因afsRScla,构建得到变铅青链霉菌菌株SBT5。将来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇导入SBT5中,接合子产生大量蓝色的放线紫红素,而出发菌株TK24只产微量蓝色抗生素;SBT5接合子的ACT产量也显著高于导入了额外act基因簇拷贝的出发菌株接合子。SBT5菌株次级代谢背景清晰,不产色素类抗生素和抗细菌抗生素,可作为高效宿主用于次级代谢产物基因簇的异源表达和筛选。     

内生细菌B196菌株与井岗霉素混配对水稻纹枯病的防治作用

[目的]为利用水稻内生细菌与农药复配对水稻纹枯病的防治提供理论指导。[方法]采用抑菌率法测定水稻内生巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）B196菌株与井岗霉素混配对水稻纹枯病菌的毒力,并测定其对水稻纹枯病的防治作用。[结果]B196菌株与5%井岗霉素水剂质量比为1∶68.47的混剂具有增效作用,共毒系数（CTC）为209,其1 000倍液对水稻纹枯病田间防效为75.57%,比单用B196菌株的防效高17.68%。[结论]内生巨大芽孢杆菌菌株B196与井岗霉素混配对水稻纹枯病的防治效果较好。     

rhtB基因过表达苏氨酸工程菌发酵过程的优化控制(英文)

[目的]构建了负责运输苏氨酸至胞外的转运蛋白的关键基因rhtB过表达的苏氨酸发酵菌M122,考察不同的碳源、氮源及pH对该重组菌产L-苏氨酸的影响。[方法]选用不同的碳、氮源对L-苏氨酸生产菌株的发酵过程进行分析,对发酵培养基的碳、氮源及pH进行优化。[结果]定向改造后苏氨酸发酵菌对营养物质的利用效率增加,使用蔗糖作为碳源发酵时,摇床培养L-苏氨酸产量为28.1g/L;以(NH4)2SO4或酵母粉作为氮源发酵时,L-苏氨酸产量分别为27.8和28.2g/L,均优于使用其他氮源时苏氨酸的产量。对发酵的最适pH研究表明,中性条件下更有利于菌体的生长和L-苏氨酸的产生。[结论]确定了苏氨酸发酵菌M122的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为(NH4)2SO4或酵母粉,最适pH为7.0。     

木霉菌M2的鉴定及其对小白菜促生效果研究

以一株分离自健康、高产辣椒根际土壤的木霉菌（Trichoderma spp.）M2 为供试菌株,研究其对小白菜生长发育的影响并在形态学分类的基础上结合rDNA-ITS 序列分析的手段,对木霉菌M2 进行分类鉴定,以期为微生物肥料的开发提供优良菌种。将木霉菌M2 进行固体发酵制得孢子粉,研究其在温室条件下是否对小白菜的生长具有促生能力。结果表明：菌株M2 属于哈茨木霉（Trichoderma harzianum）;在温室盆栽试验中,土壤接种M2 孢子粉对小白菜具有不同程度的增产作用,且能够提高叶绿素含量、可食用叶片数,其中接种5.0×10⁹ cfu 的M2 孢子粉处理的鲜重、干重最高,比对照组分别增加30.26%、20.08%;接种5.0×10⁸ cfu 的M2孢子粉处理鲜重、干重较对照组分别增加18.33%、12.46%。这说明哈茨木霉M2 菌株对小白菜的增产效果明显,具有潜在的农业应用价值。     

灵芝发酵液浓缩固形物生物活性研究

研究灵芝GL-2菌株发酵液浓缩固形物(胶事囊剂)对巨噬细胞的影响, 无论它在试管内或整体小鼠都具有促进巨噬细胞的吞噬功能。此外,在护肝作用研究中,明显降低肝脏中毒小鼠的GPT活力,GoT亦有降低趋势。对小鼠的耐力研究中,游泳时间明显延长以及提高了耐缺氧的能力,对小鼠脂质过氧化的研究中, 灵芝发酵液浓缩固形物(胶囊剂)能显著抑制50％酒精所致的心、肝匀浆、肝线粒体的MDA(丙二醛)量的升高。     

中度嗜盐菌S61生防因子分析及其对马铃薯干腐病的防效

【目的】测定中度嗜盐菌S61对马铃薯干腐病病原菌的抑菌活性及对干腐病的防效，为马铃薯干腐病的生物防治及绿色防控提供科学依据。【方法】以来源于青海察尔汗盐湖的1株中度嗜盐菌S61为材料，采用形态学、生理生化特征及分子生物学方法对菌株S61进行鉴定。通过对峙培养法和马铃薯活体试验，进行菌株S61及其发酵液有机溶剂萃取物抑制马铃薯干腐病病原菌活性测定及对储藏期马铃薯安全性评价。采用平板透明圈法和排油圈法，分别测定菌株S61发酵液分泌抑菌蛋白和产生脂肽类物质的能力。【结果】结合菌株S61的形态特征、生理生化特征和系统发育进化树分析结果，将菌株S61鉴定为特氏盐芽孢杆菌（Halobacillus trueperi）。其发酵液能产生蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，并能产生脂肽类物质。菌株S61及其有机溶剂萃取物对3株马铃薯干腐病病原菌（青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6）均有不同程度的抑菌活性，其中对青9A-4-13的抑菌活性最强，对峙培养7 d后的抑制率为55.67%。菌株S61发酵液不同浓度（1、5、10和20 mg/mL）正丁醇萃取物对青9A-4-13的抑菌活性最高，抑制率分别为61.50%、63.00%、64.00%和66.00%。菌株S61发酵液及其正丁醇萃取物对马铃薯储藏安全。【结论】中度嗜盐菌S61在体外和马铃薯活体上均对干腐病病原真菌具有抑制作用，其发酵产物的正丁醇萃取物活性最高，并存在生防因子，能产生一些具有抑菌活性的次级代谢产物，具有较好的马铃薯干腐病生物防治潜力。     

球孢白僵菌菌株Bb-2孢子侵染力和代谢产物毒力

利用球孢白僵菌菌株Bb-2(Beauveria bassiana Bb-2)活体孢子和代谢产物对2龄小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫和桃蚜(Myzus persicae)进行毒力测定.结果表明,菌株Bb-2在1.1×107、1.1×108、1.1×109个孢子/mL 3个浓度下,对2龄小菜蛾幼虫和桃蚜均表现出较高的侵染力.在高浓度(1.1×109个孢子/mL)条件下,2龄小菜蛾幼虫的4d累计死亡率为75.0％,桃蚜的4d累计死亡率为92.5％.在低浓度(1.1×107个孢子/mL)条件下,2龄小菜蛾幼虫的4d累计死亡率为36.7％,桃蚜的4d累计死亡率为47.7％.菌株Bb-2发酵液对2龄小菜蛾幼虫和桃蚜均有一定的活性,且对桃蚜的活性明显高于对小菜蛾的活性.