Cloning of hCD154 gene from human activated peripheral blood mononuclear cell and expression of hCD154-GST fusion protein in prokaryote

AIM:To express recombinant hCD154-GST fusion protein, to prepare anti-hCD154 monoclonal antibody, and to investigate the effect of anti-hCD154 monoclonal antibody on graft rejection. METHODS AND RESULTS: Total RNA was prepared from human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) activated with 10ng/mL PMA and 1 μg/mL PHA for 8h, the total RNA was reversetranscribed to cDNA. The entire coding region and a part of the 3'non-coding regions were amplified by PCR using a pair of primers designed and synthesized according to the sequence of human CD154 gene from gene bank. The amplified product, a 820bp DNA fragment was cloned into pGEX-4T-1 plasmid expressing glutathione S-transferase(GST). The cloned insert was identified by double digestion of the cloned pGEX-4T-1 plasmid with retriction enzymes BamHⅠand EcoRⅠ.The fusion protein expression plasmid of PGEX-4T-1/hCD154 was constructed, then transformed to E coli BL21. The human CD154-GST fusion protein expression was induced by IPTG in BL21. The expression of recombinant 26kD GST and 55kD human CD154-GST fusion protein were confirmed by SDS-PAGE. CONCLUSION: We have express the recombinant human CD154-GST fusion protein. The expressed hCD154-GST fusion protein will be used to prepare anti-hCD154 monoclonal antibody, to investigate the role of anti-CD154 monoclonal antibody on graft rejection.     

番茄果实酸性转化酶基因cDNA片段的克隆

根据酸性转化酶基因的保守序列设计引物 ,采用RT PCR方法 ,从番茄果实总RNA中扩增出目标cDNA片段 ,克隆到pMD18 T载体中。在所测的 10 38个核苷酸中 ,与GenBank中登记号为M810 81的番茄果实酸性转化酶基因高度同源 ,同源性为 99%。该基因片段在GenBank中已登记 ,登记号为AF4 90 5 30。     

中矮1号梨砧木(S_2)PGIP基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,根据GenBank中梨属PGIP基因序列设计1对特异引物,以梨矮化砧木S2叶片总RNA为模板,克隆到1条约1100bp的cDNA片段,将其与pMD18-Tvector连接后转化Escherichia coli JM109,对筛选到的阳性克隆进行序列测定并使用生物信息学方法对所得结果进行综合分析。结果表明,克隆片段为梨PGIP基因,该cDNA编码330个氨基酸,预测分子量为36388ku,第1～24个氨基酸残基是信号肽。与梨属其它种中已获得的PGIP核苷酸序列开放阅读框(Open reading frame,ORF)的同源性为97.5%～99.6%,氨基酸序列的同源性为97.6%～99.1%。     

甜瓜果实酸性转化酶基因cDNA片段的克隆

 根据在GenBank中登录的番茄、胡萝卜和柑桔等酸性转化酶基因的保守序列设计引物，采用RT-PCR方法，从甜瓜果实总RNA中扩增出目标cDNA片段，克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明，它与其它植物的酸性转化酶基因的同源性很高，与番茄氨基酸序列同源性为99％，说明已经成功克隆到甜瓜果实酸性转化酶基因cDNA片段，在GenBank中登记号AF490425。     

银耳α–微管蛋白基因的克隆及序列分析

 根据GenBank上已发表的其他真菌α–微管蛋白基因序列中的保守区域设计简并引物,扩增出银耳α–微管蛋白基因的cDNA部分序列。分别利用SEFA-PCR方法和RACE技术,克隆了银耳α–微管蛋白基因的DNA和cDNA全长序列。银耳α–微管蛋白基因DNA全长1 962 bp,含有9个内含子,cDNA全长1 347 bp,编码448个氨基酸。生物信息学分析结果表明：银耳α–微管蛋白基因的cDNA序列与新型隐球酵母有80%相似性,编码的蛋白质属于Tubulin_FtsZ超家族中的α–微管蛋白亚家族,氨基酸序列中存在保守的GTP结合区域GGGTGSG,系统发育树显示银耳与新型隐球酵母距离最近。     

柑橘钙调蛋白cDNA的克隆及序列分析

 以温州蜜柑(Citrus unshiu Marc. ) 幼果cDNA第1链为模板, 参照大麦钙调蛋白基因序列(Accession No. M27303) 合成5p端和3p端引物, 以PCR的方法扩增得到柑橘钙调蛋白cDNA, 将其克隆到PMD182T载体上并进行测序。序列分析表明, 柑橘钙调蛋白cDNA全长453 bp, 共编码148个氨基酸, 与大麦和大豆钙调蛋白基因的同源性均高达83%以上, 所编码氨基酸序列同源性达97%以上。以该cDNA作探针进行点杂交, 得到良好的杂交信号。     

甘蓝型油菜BnaWRKY75-like基因cDNA序列的克隆及表达分析

WRKY超基因家族能广泛地参与植物的多种生理过程及胁迫反应。该研究以甘蓝型油菜为试验材料,根据转录组测序获得的EST序列设计引物,采用RT-PCR及RACE技术克隆甘蓝型油菜WRKY转录因子基因cDNA全长序列,以期为研究该基因的功能提供参考依据。结果表明:BnaWRKY75-like基因编码序列长444 bp,推导的氨基酸序列编码147个氨基酸残基,在67～124区域含有一个典型的WRKY结构域,其中包含有"WRKYGQK"核心序列,与Brassica rapaWRKY75基因的编码序列相似性为99.77%,氨基酸序列一致。半定量RT-PCR分析表明,低温处理油菜后,BnaWRKY75-like基因的表达增强,表达峰值出现在处理3 h时,其可能在油菜低温胁迫响应中发挥作用。     

金针菇产植酸酶菌株的筛选及植酸酶基因区域的克隆

从金针菇（Flammulina velutipes）7个菌株中筛选出1株高产植酸酶菌株.根据GenBank中植酸酶基因的保守区设计并合成一对特异性引物,以金针菇菌丝的总DNA为模板,通过PCR扩增,获得了一条长约790bp的片段.DNA序列测定结果表明,该片段长度为788bp,采用Blast软件进行序列比对发现,该片段与平田头菇（Agrocybe pediades）的植酸酶基因phy（GenBankAccession：CAC48160）编码的氨基酸具有64%的序列同源性.该片段含有2个内含子,含有植酸酶基因的活性位点高度保守序列（Active-site sequence）-RHGXRXPT.     

哈密瓜ACC氧化酶cDNA克隆及其序列分析

以哈密瓜成熟果实为材料,用改进的异硫氰酸胍一步法提取总ＲＮＡ,通过ＲＴ－ＰＣＲ方法和ＤＮＡ序列测定证实获得了甜瓜ＡＣＣ氧化酶多基因家族中一个与果实后熟有关的基因ＣＭ－ＡＣＯ１的ｃＤＮＡ克隆ｐＣＭ－ＡＣ０１,序列分析结果表明该序列与国外以罗马甜瓜为材料获得的相同基因的ｃＤＮＡ序列完全相符。推断该基因在甜瓜种内可能是完全或高度保守的,不同类群之间无进化上的分歧。     

菊花FT类似基因的克隆与表达分析

以地被菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）‘七月桃花’为材料,利用同源基因克隆法结合RACE技术克隆了光周期调控开花重要基因FLOWERING LOCUS T（FT）的类似基因（基因登陆号GQ925916,命名为CmFT）。该基因开放阅读框有525 bp,可编码174个氨基酸。蛋白比对发现,CmFT所推测的氨基酸序列包含FT类蛋白保守基序和两个关键性氨基酸残基。通过系统遗传进化树分析进一步表明CmFT属于FT亚家族成员。SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析结果表明CmFT在花芽的表达量最高,茎的表达量次之,叶片表达量最低。在短日条件下,该基因的表达量呈昼夜节律表达型,在光照期间呈下降趋势,在夜间逐渐上升,光照前4 h时达到最高水平。在长日条件下,其相对表达量显著低于短日条件下且趋于零。由此推测,该基因主要与菊花光周期敏感性密切相关,可能在光周期促进开花中发挥一定的作用。     

李属坏死环斑病毒(PNRSV)新疆巴旦木分离物外壳蛋白基因(CP)片断的克隆与序列分析

【目的】为了查明新疆巴旦木果树病原病毒的种类,为病毒的分子检测提供基础。【方法】采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA),从巴旦木果树叶片中检测到李属坏死环斑病毒(PNRSV)。以阳性样品的总RNA为模板进行PNRSV外壳蛋白基因(CP)RT-PCR扩增,对预期430 bp大小的4个扩增产物进行克隆、测序和序列分析。【结果】结果表明,PNRSV新疆巴旦木分离物CP基因的核苷酸和氨基酸序列与世界各地已报道的分离物具有较高的同源性,分别为80.0%～97.2%和80.1%～94.1%,其中与阿根廷分离物AY217的同源性最高;而与同属03亚组的苹果花叶病毒(ApMV)同源性较低,仅为52.9%～55.4%和45.6%～48.6%。新疆PNRSV各分离物之间CP基因高度同源。序列比对与系统发生树的分析显示,PNRSV新疆巴旦木分离物的株系属于GroupⅠ组。【结论】确定了PNRSV为侵染新疆巴旦木果树的病原病毒。这是PNRSV在新疆发现的首次报道。     

荔枝败育胚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分析

 从荔枝‘桂味’的败育胚中提取总RNA，利用GeneRacer^TM Kit将RNA经去磷酸化反应、去mRNA的帽子结构及RNA Oligo连接，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，分别用SSH分离得到的胚败育相关差异表达s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的部分cDNA序列(599 bp)设计出3’和5’端基因特异引物，进行PCR末端扩增。荔枝败育胚的s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列全长为1515 bp，编码393个氨基酸，与其它物种的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核苷酸序列同源性在79%~82%之间，氨基酸序列同源性在88%～91%之间。结果表明所获得的基因为与荔枝胚败育相关的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因。关键词：     

柚苦味形成相关基因CmLGT的克隆与分析

为研究柚苦味形成的分子机理,以梁平柚为材料,采用PCR和RT-PCR技术扩增获得了柠檬苦素类化合物葡萄糖转移酶(LGT)基因CmLGT的DNA序列和cDNA序列。cDNA长1536bp,推测的编码蛋白CmLGT包含511个氨基酸,理论分子量为57.5ku,具有1个含有44个氨基酸残基的UDP-葡萄糖结合域(UDP-glucose Binding Domain),2个含有4个氨基酸残基的保守糖基化位点。扩增得到的CmLGT基因DNA和cDNA存在26个碱基的差异,可能是DNA和cDNA分别进行扩增时,其模板为同一位点上的等位基因造成的。     

月季切花乙烯受体ETR1 cDNA克隆及其序列分析*

 根据乙烯受体基因ETR1 保守区设计引物, 分别以瓶插寿命差异显著的月季切花品种‘德克萨斯’和‘维亚蒂’为材料, 通过RT-PCR 从花瓣中扩增出了797 bp 的cDNA 片段, 它编码265 个氨基酸。测序和序列分析表明,‘德克萨斯’重组质粒中插入片段的核苷酸序列之间完全相同, 命名为pRT-ETR1。而‘维亚蒂’所获得的重组质粒中插入片段的核苷酸和氨基酸序列之间存在差异, 同源性分别为85. 2 %和92. 1 % , 分别命名为pRV-ETR1-V4 和pRV-ETR1-V5。pRV2 ETR12V5 的核苷酸和氨基酸序列与‘德克萨斯’pRT2 ETR1 的同源性均达99 %以上; pRV-ETR1-V4 中的核苷酸和氨基酸序列与‘德克萨斯’pRT-ETR1 的同源性分别为85. 0 %和92. 5 %。上述插入片段与桃、苹果、天竺葵、拟南芥等植物的ETR1相应区域高度同源, 其氨基酸同源性均大于90 %。     

柚苦昧形成相关基因CmLGT的克隆与分析

为研究柚苦味形成的分子机理,以梁平柚为材料,采用PCR和RT-PCR技术扩增获得了柠檬苦素类化合物葡萄糖转移酶(LGT)基因CmLGT的DNA序列和cDNA序列。cDNA长1536bp,推测的编码蛋白CmLGT包含511个氨基酸,理论分子量为57.5ku,具有1个含有44个氨基酸残基的UDP-葡萄糖结合域(UDP-glucose Binding Domain),2个含有4个氨基酸残基的保守糖基化位点。扩增得到的CmLGT基因DNA和cDNA存在26个碱基的差异,可能是DNA和cDNA分别进行扩增时,其模板为同一位点上的等位基因造成的。     

甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据在GenBank中登录的番茄、马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物, 采用RT-PCR方法从甜瓜花后25 d的果实总RNA中扩增出目标cDNA片段, 克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明, 该片段与番茄蔗糖磷酸合成酶氨基酸序列同源性为98.9% , GenBank中登记号为DQ355797。通过Northern blot检测其在甜瓜果实不同发育时期的表达变化, 结果表明该基因在甜瓜果实花后25 d开始表达,随着果实的成熟, 表达量升高。     

香蕉果实果胶裂解酶基因cDNA克隆及序列分析

利用已报道果胶裂解酶基因的保守序列设计简并引物,进行RT-PCR,得到1个大约1300bp的香蕉果胶裂解酶基因cDNA片段,命名为MA-pl。DNA序列分析表明:MA-pl片段全长1277bp,包含1个882bp的开放读码框(ORF),编码294个氨基酸;其具有所有果胶裂解酶共有的保守区域:钙协调部位(Asp72,Asp74,Asp96,andAsp100)、酶活性位点(Arg152,Pro154,Arg157)及3个重要的结构域(motifI:WVDH,motifII:DGLVDAVMGSTAITVSNNYF,motifIII:LYQRMPRCRHGYFHVVWNDY);MA-pl氨基酸序列与草莓-1、葡萄、草莓-2、拟南芥、苹果、香蕉(banana-1)的相似性分别为85.8%、74.2%、79.7%、78.6%、72.4%和71.4%。     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体的构建

应用反义RNA技术抑制甜瓜成熟过程中内源乙烯的合成,从而培育耐贮运品种是解决甜瓜延熟保鲜难题的可行新方法。根据GenBank中甜瓜、黄瓜ACC合成酶基因氨基酸保守序列设计引物,从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到约0.7kb的ACC合成酶cDNA片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为777bp,编码258个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶cDNA反义表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

Construction and sequence analysis of eukaryotic expression vector of Chinese prostate-specific membrane antigen

AIM: To obtain eukaryotic expression vector of Chinese prostate-specific membrane antigen. METHODS: Chinese prostate-specific membrane antigen (PSMA) cDNA was amplified by RT-PCR from prostate cancer tissues, then cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.0 and sequenced. RESULTS: Seven bases in Chinese PSMA cDNA sequence were found different from those reported by Israeli, which lead to two different amino acids. CONCLUSION: We have obtained the PSMA cDNA, and the recombinant eukaryotic expression vector was successfully constructed. The study lays foundation for DCs vaccine modified by PSMA gene for the treatment of prostate neoplasms.