沙子岭猪ASB17基因克隆、生物信息学分析及组织差异表达研究

本研究利用RACE法克隆沙子岭猪ASB17基因cDNA全长并进行生物信息学分析,应用实时荧光定量PCR对ASB17基因在沙子岭猪D30时期9个不同组织（睾丸、肌肉、小肠、肺脏、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、脂肪）及睾丸组织8个不同发育阶段（E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180）进行差异表达分析。结果显示,ASB17基因克隆所得片段长1 135 bp,其中ORF区为888 bp,编码295个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示沙子岭猪D30时期ASB17 mRNA在睾丸中表达量最高,其次为脂肪及脾脏,而在肌肉及小肠中表达量最低,其中睾丸与肌肉、小肠及肺脏中表达量差异显著（P<0.05）;睾丸组织不同发育时期中,ASB17 mRNA在D120、D150时期表达量达到最高,在D180时期表达量略有下降,其中E90、D1、D30、D60与D90、D120、D150、D180时期差异极显著（P<0.01）;D90与D180时期差异不显著（P>0.05）,与其余时期均差异极显著（P<0.01）;沙子岭猪性成熟期D120、D150、D180 3个时期表达量差异不显著（P>0.05）。本试验成功克隆了沙子岭猪ASB17基因cDNA全长并检测了其在猪不同组织及睾丸组织不同发育阶段表达量,为进一步研究ASB17基因功能奠定基础。     

沙子岭猪跨膜与卷曲螺旋域2(TMCO2)基因克隆、生物信息学及组织差异表达分析

利用RACE法克隆沙子岭猪TMCO2基因cDNA全长并进行生物信息学分析,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对TMCO2基因在沙子岭猪D30时期8个不同组织(睾丸、肌肉、肺、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、脂肪)及睾丸组织8个不同发育阶段(E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180)进行差异表达分析。结果表明:TMCO2基因克隆所得片段长740 bp,其中ORF区为546 bp,编码181个氨基酸。qRT-PCR结果显示,沙子岭猪D30时期TMCO2 mRNA在睾丸组织中表达量最高,其次为脾脏组织,而在其他组织中表达量极低,其中睾丸组织与其他组织表达量差异均为显著(P0.05);睾丸组织不同发育时期中,TMCO2 mRNA在D180时期表达量达到最高,在D1和D150时期表达量略有下降,其中D180与其他时期的差异均为极显著(P0.01),E90、D1、D30、D60 4个生长发育期时期表达量差异不显著(P0.05)。本试验首次克隆了沙子岭猪TMCO2基因cDNA全长并检测了其在猪不同组织及睾丸组织不同发育阶段表达量,为进一步研究TMCO2基因功能奠定基础。     

MYNN基因在猪不同组织及肌肉中的表达规律

试验旨在研究myoneurin（MYNN）基因在猪不同组织中的表达特征及其在肌肉（背最长肌、股二头肌和腰大肌）、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的发育性表达规律。采用实时荧光定量PCR技术研究猪MYNN mRNA在90日龄大白猪和马身猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小脑、小肠、胰脏、胃、股二头肌及脂肪共11个组织中的表达谱,以及在大白猪和马身猪1、90、180日龄3个发育阶段的肌肉、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的发育性表达规律。结果表明,MYNN在猪的各种组织中广泛表达,且各组织间表达差异显著或极显著（P < 0.05;P < 0.01）;MYNN在大白猪和马身猪的肌肉、小脑、肝脏、胰脏、肾脏、胃、脾脏、肺脏组织中的不同发育阶段表达差异显著或极显著（P < 0.05;P < 0.01）,并具有特定规律,由此推测其可能在猪的这几种组织中发挥重要作用。MYNN基因的表达与组织、日龄及品种的遗传背景有关。本试验为研究猪MYNN基因的生物学功能提供了依据,但还需要深入的研究来探索其作用的具体机制,尤其是在骨骼肌发育中的调节机制。     

miR-450基因家族进化分析及其在沙子岭猪睾丸组织表达量分析

为探明miR-450基因家族(miR-450s)的系统进化历程及其在沙子岭猪睾丸组织不同发育时期表达规律。通过miRBase数据库检索miR-450s序列,利用Ensembl数据库信息确定miR-450s在不同物种中的基因组定位,采用MEGA 6.0构建miR-450基因家族的系统进化树,并利用RT-q PCR检测miR-450s在沙子岭猪睾丸组织不同发育期(E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180)的表达变化。miRBase数据库共检索15个物种36条miR-450s序列,且miR-450s序列具有高度保守性。基因组定位显示miR-450s位于X染色体上,均位于基因间隔区(Intergenic region,IGR),且miR-450基因家族成员在进化过程中紧密相连,可能由于串联重复所致。RT-q PCR结果显示,miR-450s在胚胎期中表达量显著高于出生后表达量(P0.01),且miR-450基因家族3个成员(miR-450a、miR-450b、miR-450c)在沙子岭猪睾丸不同发育阶段呈现出协同表达的特性。miR-450基因家族可能在猪睾丸组织发育过程中发挥重要调控作用。     

猪ADAR1基因cDNA全长克隆、序列信息及组织表达分析

旨在克隆猪作用于RNA的腺苷脱氨酶1基因(ADAR1)cDNA全长序列,检测该基因在大白猪不同组织及不同日龄背膘中的表达情况。本研究利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)克隆大白猪ADAR1基因mRNA全长序列,并对其进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR方法检测ADAR1在不同组织中的表达水平,并探究不同日龄背膘中ADAR1的表达规律。结果表明,猪ADAR1基因cDNA全长6259bp,编码1145个氨基酸,与人、黑猩猩、猕猴、长臂猿、黄牛、山羊和绵羊的氨基酸序列一致性均不低于85%。该基因编码的蛋白具有2个Zα结合结构域,3个双链RNA结合结构域和1个脱氨酶结构域。ADAR1在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、小肠和背部脂肪组织以及7、60、120和180日龄个体背膘组织中均表达,其表达量总体上表现出随个体发育先下降后上升的趋势。综上所述,本研究成功克隆了猪ADAR1基因cDNA全长序列,发现其在猪体内广泛表达,并且在不同日龄猪背膘组织中表达水平存在差异,为今后深入研究ADAR1的功能奠定了理论基础。     

猪ApoA5基因cDNA的克隆、序列分析及组织表达研究

旨在克隆猪ApoA5基因cDNA全序列,并对其进行序列分析,研究该基因的组织表达规律.试验以山西马身猪肝脏组织为材料,采用RT-PCR与RACE技术,对猪ApoA5基因的cDNA进行克隆,并对其进行了生物信息学分析.采用荧光定量PCR检测并分析了ApoA5 mRNA在2个猪种(马身猪和大白猪)中多个组织的表达规律.结果表明:猪ApoA5基因cDNA全长1 917 bp,包括1 092 bp的开放阅读框(ORF),24 bp的3'-UTR和801 bp的5'-UTR;编码区(CDS)共编码364个氨基酸,与牛、马、人、犬、猴、兔、褐鼠和小鼠氨基酸序列的同源性分别为81.7％、80.0％、78.3％、77.5％、76.5％、73.6％、67.1％和66.7％;ApoA5 mRNA除了在肺脏和脾脏中未检测到外,在其他8种组织中均有表达,其中在肝脏组织中高丰度表达,在皮下脂肪与背最长肌中中等表达,低量表达于小肠、肾脏、心脏、胰脏和胃,并且在皮下脂肪与背最长肌中ApoA5 mRNA的表达量存在显著的品种差异.猪ApoA5基因在动物进化中比较保守,ApoA5 mRNA的表达量受到组织和品种影响,推测ApoA5基因对脂肪沉积性状有一定的影响.     

miR-24基因家族进化及其在猪睾丸组织中的表达变化分析

通过miRBase数据库检索miR-24基因家族序列,利用Ensembl数据库信息确定miR-24家族在不同物种中的基因组定位,采用MEGA 5.0构建miR-24基因家族的系统进化树,并利用RT-qPCR检测miR-24-1及miR-24-2在沙子岭猪睾丸组织不同发育期(E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180)的表达变化。在miRBase数据库检索32个物种共66条序列,且各序列均具有高度保守性。基因组定位显示大部分物种的miR-24基因位于常染色体上。RT-qPCR结果显示,miR-24基因家族2个成员(miR-24-1、miR-24-2)在沙子岭猪睾丸不同发育阶段呈现出协同表达的规律。本研究对miR-24基因家族进行系统进化分析并检测其在沙子岭猪睾丸组织中表达变化规律,为进一步探明miR-24基因家族的功能及作用机制奠定基础。     

miR-126-5p在沙子岭猪睾丸组织差异表达分析及功能预测

利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测miR-126-5p在沙子岭猪睾丸组织8个不同发育时期(E90、D1、D30、D60、D90、D120、D150、D180)表达量,以了解其在动物睾丸发育及精子生成中的作用。利用miRanda、TargetScan和mirWalk 3个数据库预测miR-126-5p靶基因并取交集,利用David在线软件分析miR-126-5p靶基因的生物功能。结果表明,miR-126-5p在胚胎期(E90-D1)睾丸组织中高表达,而在生长期(D1-D90)表达量下调,但在沙子岭猪性成熟(D120)后表达量又上调,其中D1表达量最高,D90表达量最低,且二者与其他7个时期均差异极显著(P0.01);D30、E90、D180相互之间差异不显著(P0.05),且分别与其余各时期差异极显著(P0.01);D120与D30差异显著(P0.05),与其余各时期差异极显著(P0.01);D150与D60之间差异不显著(P0.05),二者分别与其余各时期差异极显著(P0.01)。miR-126-5p靶基因参与细胞增殖、凋亡、分化、细胞通讯、迁移及蛋白质转运等生物学过程(P0.001);靶基因分子功能包括蛋白二聚体活性、配体依赖性核受体活性(P0.001);KEGG分析显示miR-126-5p靶基因参与TGF-β、MAPK、细胞黏附等信号通路(P0.01)。结合miR-126-5p在睾丸组织不同发育时期表达差异结果及其靶基因功能预测结果,miR-126-5p可能参与沙子岭猪生殖细胞分化及精子生成调控,本研究为miR-126-5p在动物精子生中的作用及其调控机制的研究提供依据。     

梅山猪SLC36A1基因cDNA克隆、组织表达及生物信息学分析

为了研究SLC36A1基因的功能及其与梅山猪毛色等表现的关系,试验以梅山猪皮肤组织cDNA为模板,PCR扩增SLC36A1基因完整CDS序列,利用生物信息学方法分析SLC36A1基因CDS序列及其编码的氨基酸序列,用RT-PCR方法检测SLC36A1基因在梅山猪各组织中的相对表达量。结果表明:SLC36A1基因CDS全长为1 431 bp,编码476个氨基酸,属于跨膜疏水性蛋白,具有转运功能,是比较保守的基因;RT-PCR检测该基因在梅山猪雄性生殖系统及肾脏中有较高的表达量,在肝脏、肌肉、子宫、输卵管等组织中表达量很低,并且首次发现该基因在尿道球腺中有最高的表达量。     

猪TIMP-2基因克隆、序列特征和表达分析

本研究分析了五指山试验用小型猪TIMP-2基因的分子特性和可能的生物学功能.将人TIMP-2 mR-NA全长序列在猪ESTs数据库中检索获得同源性较高的ESTs,用电子克隆结合RT-PCR方法克隆获得包含完整CDS区的猪TIMP-2基因cDNA序列,应用生物信息学方法分析了其核苷酸序列及其编码蛋白质分子结构特性,应用RT-PCR研究该基因在猪不同组织和发育时期的特异表达情况.结果,猪TIMP-2 cDNA序列全长790 bp,包括663 bp的完整开放阅读框,编码221个氨基酸.多序列比对和系统进化分析表明,该基因编码蛋白质与人(97%)、大鼠(97%)、小鼠(97%)等物种TIMP-2蛋白质具有较高的同源性.蛋白质序列预测分析发现,猪TIMP-2氨基酸序列理论等电点(pI)为7.65,相对分子质量(MW)为24.5 ku,它包括27AA的前导序列和194AA的成熟肽段,其前导序列比其它物种多1个亮氨酸(Leu).结构功能预测发现其具有1个在种间高度保守的NTR_TIMP结构域和N端VIRAK保守序列,序列中存在的12个半胱氨酸(Cys)可以形成6对二硫键结构.表达谱分析表明TIMP-2基因在猪的多个组织和不同发育时期的表达量存在较大差异,在睾丸、垂体、胃、大肠、卵巢、子宫和90 d胚胎骨骼肌中高表达;而在心脏、小肠、脑、肝脏、成年猪骨骼肌中表达量极低;在肾脏、胸腺、脾、甲状腺、33 d胚胎中中度表达.结果表明该基因在发生组织发育和重构活动相对活跃的组织器官和时期表达水平较高,亦符合其固有生物学功能.