Screening of the differentially expressed genes in lymphocytes of patients with unstable angina with suppression subtractive hybridization

AIM: To screen and identify the differentially expressed genes in lymphocytes of patients with unstable angina in order to find the molecular mechanism of unstable angina . METHODS: Suppression subtractive hybridizations (SSH) and dot blot hybridizations were performed to screen the relatively differentially expressed genes in lymphocyte RNA between the patients with unstable angina pectoris and stable angina pectoris. The obtained expressed sequence tags (ESTs) were used as probes to perform Reverse Northern blot with forward and reverse suppression products. And the positive ESTs were performed RNA slot hybridization with unstable and stable angina group. The obtained ESTs were sequenced and analyzed using BLAST (nr) at NCBI. RESULTS: Three up-regulated ESTs in the unstable angina group, and one down-regulated EST in the stable angina group were obtained. All of them are sequences of known genes. CONCLUSION: All these ESTs may be associated with the unstablization of plaque of coronary artery in patients with unstable angina.     

草原龙胆盐胁迫差减文库的构建及分析1

为了研究草原龙胆抗盐性机理,初步获得其抗盐性相关基因,分别以400 mmol·L-1的NaCl及清水处理的草原龙胆叶片mRNA为tester和driver方,利用抑制差减杂交技术构建了cDNA文库。经过测序和与GO数据库序列比对,获得了658条单一序列,其中61条序列分子功能未知,535条序列无同源性,62条序列有显著同源性。此62条序列注释按照功能分为21类。获得了活性氧清除系统基因DHAR、GST、TRX、CAT,转录因子SMT3,调控基因丝氨酸/苏氨酸激酶基因等。结果说明草原龙胆的盐抗性相关基因与数据库中的模式植物基因既有一定的共性,同时绝大部分的序列又无法用已知的基因进行解释。     

抑制性消减杂交分离苹果缺铁诱导的相关基因

以铁高效基因型植物———苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et J iang) 为材料, 利用抑制性消减杂交( SSH) 方法, 成功构建了小金海棠缺铁条件下的消减cDNA文库。该文库包含1 152个克隆, 通过PCR检测插入片段大小在300～1 000 bp之间。对构建的消减cDNA文库进行差异筛选, 得到差异表达片段( ESTs) 105个。GenBank上BLAST结果如下: 50个ESTs与其它物种同源性较高, 视为已知基因, 并根据其功能分为9个组; 32个ESTs在GenBank中无法查到对应的同源序列, 可能代表了新基因;另外23个是与已知ESTs重复的基因片段。     

‘岩溪晚芦’椪柑果皮与果肉差减cDNA文库的构建及初步分析

 以‘岩溪晚芦’(Citrus reticulata Blanco)成熟果皮和果肉为材料,采用抑制性差减杂交技术,成功构建了果皮（tester）与果肉（driver）的差减cDNA文库。结果显示：cDNA克隆外源插入片段大小介于100～500 bp之间。成功对411个克隆进行了测序,测序结果经与NCBI基因库中序列进行比较,377个EST 找到了同源序列,它们分属于126个基因,涉及到与色素合成、能量代谢、初级代谢、次生代谢、抗逆防御、蛋白代谢、信号转导、香味形成、果皮软化（衰老）、精油合成、抗氧化代谢等代谢途径和生理生化过程。还有一些基因涉及到三价铁螯合物、反转录转座子gag蛋白、查尔酮合成、硼离子转运、儿茶酚氧位甲基转移酶等功能。功能已知且没有重复的EST共有63个,占总数的49.2%。有5个基因共62个克隆虽在Blast搜索时找到了较高的同源性序列,但功能目前尚未明确,有待进一步深入分析。另有34个基因未搜索到同源序列,可能为新发现的基因。     

结球甘蓝cDNA文库的构建和鉴定

 构建了结球甘蓝cDNA 文库。文库的宿主菌为E. coli XL1-lue。对文库的部分特性进行研究,滴度为2 ×10⁸～4 ×10⁸ pfu/ mL , 插入片段的大小均在500 bp 以上, 以1kb 以上的片段占大多数, 重组体的重组率为95 % , 用抗病基因片段作探针进行噬菌体原位杂交, 杂交信号明显。对文库进行了扩增、保存。     

应用抑制性消减杂交分离板栗短雄花序芽变相关基因

利用抑制性消减杂交技术分离了板栗正常花序与芽变花序之间表达的差异cDNA片段。以芽变板栗雄花序cDNA为试验方(tester),以对照板栗雄花序cDNA为驱动方(driver),构建了一个板栗芽变花序消减文库。菌落PCR显示插入片段主要在100～1000 bp,文库质量良好。通过对文库阳性克隆随机测序共得到了30个有效EST序列。利用Blast同源性比较,其中一些EST可能与板栗雄花序发育中变短的生物学形态形成密切相关,为后续板栗短雄花序芽变相关基因的研究奠定了基础。     

黄龙病诱导下椪柑SSH文库的构建与分析

以实生苗和平椪柑(Citrus reticulate Blanco)为材料,采用抑制性差减杂交技术,分别以感染黄龙病与未感染黄龙病的椪柑叶片为检测方(tester)和驱动方(driver),成功构建了黄龙病诱导的差减cDNA文库。挑选了100个阳性克隆并成功测序得到71条EST,经NCBI基因库同源性比对,有41条非冗余高质量EST序列找到了同源序列,另有10条非冗余未搜索到同源序列。同源序列的基因涉及抗逆防御、运输、能量代谢、光合作用、蛋白代谢、信号转导、抗氧化等代谢途径和生理生化过程。值得注意的是文库中有由病原引起的韧皮部相关的凝集素蛋白的前体积累。挑选了2条进行Q-PCR定量分析,结果表明感病1周表达量增强不大,2周后tester的表达量明显高于driver,说明材料感病早期这些基因表达增强。     

Inhibitory effect of high-dose Xuezhikang on inflammatory response induced by percutaneous coronary intervention in patients with unstable angina

AIM: To study the inhibitory effect of high-dose Xuezhikang,administered before percutaneous coronary intervention (PCI) on inflammatory response induced by PCI in patients with unstable angina (UA).METHODS: All patients with UA in class Ⅲ and ⅡB according to Braunwald classification were considered for inclusion in the present study.Finally,196 patients received Xuezhikang treatment 72 h before coronary angiography and successfully performed PCI with elevated C-reactive protein (CRP) level (>3 mg/L) were randomised to 2 groups: 1.2 g/d of Xuezhikang as group A,or 2.4 g/d of Xuezhikang as group B.The levels of CRP were measured at baseline,after 3 days of therapy (before procedure) and 48 hours after PCI.The patients were followed-up for 6 months for major adverse coronary events and left ventricular ejection fraction.RESULTS: There was no significant difference in the mean CRP level among the two randomized groups (P>0.05),however,after three days of pharmacological treatment,there was significantly reduced CRP content in group A ［(5.44±1.57） mg/L vs （4.04±1.54） mg/L,P<0.05］ and in group B ［(5.42±1.36） mg/L vs （3.60±1.14） mg/L,P<0.05］ compared with admission.Measurements performed 48 hours after the procedure revealed a marked CRP level increase in group A (up to 9.22 mg/L±5.03 mg/L) and an obvious increase in groups B (up to 4.97 mg/L±1.75 mg/L,P<0.05) compared with pre-procedure.The serum level of CRP in B group was distinctly lower than that in A group before (P<0.05) and after the procedure (P<0.05),respectively.Major adverse coronary events during the 6-month clinical follow-up occurred less in group A than that in group B ［21/104 (20.2%) vs 9/92 (9.8%); patients,P<0.05］.Follow-up echocardiography revealed lower left ventricular ejection fraction in group A than that in group B (55.41%±10.93% vs 59.30%±9.99%,P<0.05).CONCLUSION: High-dose Xuezhikang therapy,administered before PCI,has better inhibition effect than low-dose on inflammatory response induced by PCI in patients with UA.Attenuation of inflammatory response may be crucial for the reduction of coronary events following invasive coronary interventions.     

辣椒细胞质雄性不育系和保持系SSH-cDNA文库的构建

以辣椒细胞质雄性不育系A1、A5为驱动方(driver),以其相应的保持系B1、B5为测验方(tester),利用抑制差减杂交技术构建了1个辣椒细胞质雄性不育保持系表达基因的正向差减cDNA文库。从差减文库中筛选到189个阳性单克隆,经高密度点阵膜杂交筛选和测序分析,共获得了42条表达序列标签(ESTs)。BLAST比对分析后,得到了35条有比对结果的序列,其中包括26条已知功能基因序列和9条未知功能基因序列,已知基因功能多与基础物质代谢、胁迫应答、信号转导等方面有关;有7条ESTs没有比对结果,可能代表一些新基因。     

金钗石斛花芽cDNA表达文库的构建及鉴定

 cDNA文库是分离、筛选基因的重要平台。利用SMARTTM cDNA library construction技术, 成功构建了金钗石斛花芽cDNA表达文库。结果表明该文库的克隆数为3.02 ×10⁵ pfu, 插入片段的大小在0.5～2.5 kb范围, 插入片段的重组率接近100% , 说明所构建的cDNA文库质量较好。该文库的构建为克隆与金钗石斛花芽分化相关功能基因奠定了基础。     

‘津田’芜菁消减cDNA文库的构建及分析

 以‘津田’芜菁红色块根和白色块根为材料, 利用SSH技术成功构建了消减cDNA文库并富集相关基因片段。从消减文库中筛选到960个阳性克隆, PCR鉴定插入片段长度主要分布于300～800 bp之间。克隆测序后与GenBank中的同源序列进行比较, 特异基因片段为302个, 其中99个与数据库中的序列具有相似区域且功能已知, 与数据库中序列没有显著同源性及功能未知的序列为203条。     

柑橘衰退病晚期抑制差减cDNA文库的构建及初步分析

为了研究柑橘衰退病晚期应答的分子机理,利用经典的抑制差减杂交技术,以感染柑橘衰退病3年后的‘不知火’杂柑实生苗叶片组织的c DNA为测试方,以脱毒的‘不知火’实生苗叶片组织的c DNA为驱动方进行差减杂交,构建了柑橘衰退病诱导的正向抑制差减c DNA文库。随机挑取此文库中210个阳性克隆进行测序,获得了192条有效序列。将这些EST序列聚类拼接后,共获得77条非重复序列。对这些EST进行GO和KEGG分析,发现这些EST的功能主要与胁迫及防御、代谢、转录、转运、蛋白命运等途径相关。用实时定量RT-PCR验证了其中4个基因:几丁质酶基因、茉莉酸响应基因的转录抑制因子1基因(JAZ1)、钙调素结合蛋白基因、咖啡酸—氧甲基转移酶基因,结果表明在衰退病的诱导下,‘不知火’杂柑叶片中这4个基因的表达量均有明显提高,说明这些基因可能参与了‘不知火’杂柑叶片晚期衰退病应答。JAZ1基因的上调表达表明可能宿主衰退病晚期应答过程中的诱导系统抗性受到了抑制。     

高盐胁迫下的草原龙胆基因表达分析

为了更好的理解植物对盐胁迫的反应的分子机理,结合差减抑制杂交技术和基因芯片的方法,研究了草原龙胆对于高盐胁迫响应重要性和新基因.先利用草原龙胆50#叶片进行盐处理和非盐处理,并以此构建抑制差减文库.从此文库中选取部分克隆构建了草原龙胆基因芯片,进行了芯片分析,研究了高盐处理对非处理条件下的基因表达变化.在3 h的高盐胁迫下,基因芯片分析显示有36个单一基因有差异表达,大多数基因未见报道.这些基因的存在表明盐胁迫导致了草原龙胆复杂的胁迫响应.     

枳根cDNA全长文库的构建与分析

为了解柑橘优良砧木枳（Poncirus trifoliata）根部的基因表达信息,利用SMART技术构建了枳的根组织全长cDNA文库。检测结果显示所建枳根原始文库的容量为1.08 × 106 cfu ? mL-1,扩增后文库容量为1.30 × 109 cfu ? mL-1,重组率为95%。通过文库随机测序获得182个长度大于100 bp的ESTs序列（GenBank登录号为JK316116 ~ JK316297）,序列拼接后得到96个Unigenes,包括12个Contigs和84个singletons。其中,68个Unigenes可与GenBank中登录的基因相匹配,56个与已知的柑橘基因相匹配,36个为全长基因。对24个全长基因完成了功能注释,并进一步开展了生物信息学分析,发现有6个应激反应基因和3个根发育相关基因。     

植物基因克隆技术的发展与展望

抑制性差减杂交技术和基因芯片技术是近年来发展起来的研究基因差异表达的2种非常有效的方法.SSH技术或基因芯片技术单独使用都存在不同程度的缺陷和不足,但若将2种技术结合起来使用,则能充分发挥各自的优势,并最大限度地弥补各自的不足.鉴于此,对SSH技术与基因芯片技术的原理与优缺点以及两者的结合在植物研究上的应用进行了综述.     

辣椒Me3基因介导抗根结线虫相关基因的SSH分析

以辣椒（Capsicum annuum L.）双单倍体HDA149为试验材料,接种南方根结线虫（Meloidogyne incognita）12、24、36 h的根尖材料作为测验方(Tester),相应的未接种根尖材料作为驱动方(Driver),构建一个南方根结线虫诱导Me3 基因表达早期的抑制消减杂交cDNA文库,通过高密度点阵膜杂交差异筛选,获得了309条表达序列标签(EST)。通过测序,除去重复序列共得到259条EST序列,在GenBank上进行BLAST分析,30个EST片段未发现同源性基因,229个为具有同源性的已知基因,其中71个为功能未知的基因。在显微观察和抗性相关EST表达谱分析的基础上,推测在Me3基因介导的不亲和互作中,编码NBS-LRR结构的抗病基因参与了寄主对根结线虫的识别,激发了过敏性坏死反应的信号基因, 同时多种抗性相关的转录因子基因表达, 使以代谢为基础的防御反应和保护机制发挥抗线虫作用。