黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

[目的]以毕赤酵母（Pichia pastoris）X33为宿主菌高效表达黑曲霉（Aspergillus niger）糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础。[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.nigerCBS513.88糖化酶的cDNA序列（glaA）设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸。以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经NsiI线性化后,电击转化毕赤酵母X-33。摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌。[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml（发酵液）。重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为6065℃和4.0,在pH2.55.5范围内均保持90%以上的酶活力。该酶具有较高的热稳定性,pH4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min。[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达。     

酿酒酵母和糖化酵母核倍性融合株的生长与生理特性研究

出发菌株是通过原生质体融合而获得的酿酒酵母菌株ＨＵ－ＴＹ－１Ａ与糖化酵母菌株５２０６－１Ｂ的不同核倍性融合株。经对其生长速率、生长量、耐渗性、耐酒精能力以及发酵力等的测定,表明均不同于原双亲株ＨＵ－ＴＹ－１Ａ和５２０６－１Ｂ;     

酿酒酵母与糖化酵母的核倍性融合株的构建

在探讨原生质体制备、融合及再生条件的基础上，采用聚乙二醇（ＰＥＧ）对耐高温的酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＵ－ＴＹ－１Ａ菌株和淀粉发酵力最强的糖化酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉ－ａｓｔａｔｉｃｕｓ）５２０６－１Ｂ菌株进行种间或同株间的原生质体融合，获得了数株ＨＵ－ＴＹ－１Ａ和５２０６－１Ｂ的同株以及种间融合株，融合率为（１．３～９．０）×１０￣（－６）．通过测定融合株的细胞体积大小、ＤＮＡ含量、遗传稳定性和营养要求等表明：融合株细胞体积和ＤＮＡ含量约为两亲株之和；种间融会株具有双亲株的遗传特性；融合株的倍性为２ｎ，３ｎ，４ｎ及５ｎ。     

酿酒酵母和糖化酵母核倍性融合株的生长与生理特性研究

出发菌株是通过原生质体融合而获得的酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株ＨＵ－ＴＹ－１Ａ与糖化酵母（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）菌株５２０６－１Ｂ的不同核倍性融合株．经对其生长速率、生物量、耐渗性、耐酒精能力以及发酵力等的测定,表明均不同于原双亲株ＨＵ－ＴＹ－１Ａ和５２０６－１Ｂ;同时发现两株性状优异的四倍体菌株：４ＡＢ２－６０和４ＢＡ１－３．在３０℃培养时,其生长速率和生物量略高于亲株或与之相当,４０℃时明显高于双亲株,耐高渗、耐酒精能力高于５２０６－１Ｂ,与ＨＵ－ＴＹ－１Ａ相当;３０℃淀粉发酵与５２０６－１Ｂ接近,４０℃时则优于５２０６－１Ｂ;３０℃葡萄糖发酵,４ＢＡ１－３低于５２０６－１Ｂ,高于ＨＵ－ＴＹ－１Ａ,４ＡＢ２－６０则优于双亲株,４０℃时,４ＡＢ２－６０和４ＢＡ１－３均优于双亲株．同时我们还发现不同倍性的同株融合株之间存在一定的基因表达剂量效应．     

外源基因在酵母中表达

阐述了酵母高效表达外源基因的载体系统，转化，转录和翻译，翻译后的蛋白质加工和分泌，对表达外源基因中出现的一些问题及其解决方法作了探讨。     

红曲米糖化酶提取工艺及其糖化力测定方法选优

研究了固液比、提取温度和时间对制备的福建红曲米粗酶液酶活的影响,比较了以碘量法、DNS法和菲林试剂法的红曲米糖化力测定结果,并进行红曲黄酒酿造验证糖化力检测试验。结果表明,红曲米糖化酶最佳提取方式为选择固液比(m∶V)=1g∶25mL,红曲米粉末于缓冲液溶解摇匀后立即过滤,取滤液检测。碘量法与DNS法均为红曲米糖化酶适宜的检测方法,两种方法检测数据具有可比性。从时效性考虑,碘量法适宜少量样品测定,DNS法适宜用于快速测定多个样品。经酿造验证,红曲米糖化力的测定值与以其为糖化剂的黄酒出酒率检测结果是一致。     

酿酒酵母和异常汉逊酵母在酿酒过程中的相互作用

[目的]探究酿酒酵母与异常汉逊酵母在半固态白酒酿造过程中的相互作用。[方法]在白酒酿造过程中,通过对微生物纯培养和混合培养过程中微生物数目变化、理化指标变化来探究酿酒酵母与异常汉逊酵母间的相互作用。[结果]在酿酒酵母、异常汉逊酵母共培养过程中,异常汉逊酵母经过24 h短暂生长后迅速衰亡;对可能引起异常汉逊酵母衰亡的因子包括碳源、酒精度、p H、酵母无细胞滤液的初步研究,发现在酿酒酵母无细胞滤液和混合酵母无细胞滤液中,异常汉逊酵母生长受到明显抑制而酿酒酵母生长正常。[结论]异常汉逊酵母和酿酒酵母共培养时,异常汉逊酵母的生长受到明显抑制,酿酒酵母的代谢产物是抑制其生长的主要原因。     

原生质体融合和秋水仙素染色体加倍构建强发酵淀粉的糖化酵母研究

通过原生质体融合或秋水仙素染色体加倍技术 ,构建成交配型位点基因纯合 (α/α)的二倍体 .对所获二倍体及其亲株的糖化酶酶活性进行测定 .结果表明 ,这 3个非连锁的糖化酶等效异位基因表现出显著的剂量效应 ,应用中 3株纯合二倍体CIY187 14 (STA3/STA3) ,SFY5 5 (STA2 /STA2 )和CI12C 6 6 (STA1/STA1)菌株 ,其酶活性分别是其亲株的 2 4 4 ,2 31和 2 31倍 ,说明利用糖化酶基因的剂量效应可以获得高酶活性的糖化酵母新菌株     

鸡γ干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

为了获得高效分泌表达ChIFNγ的重组毕赤酵母菌株,利用基因工程技术,将435 bp的ChIFNγ成熟肽编码基因亚克隆到巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体PPICZαC中,将该重组质粒用BstX Ⅰ线性化并通过电击法转化毕赤酵母X-33菌株,用500 μ/mL抗生素Zeocin筛选高拷贝阳性重组菌.甲醇诱导表达的重组ChIFNγ经SDS-PAGE电泳,可在相对分子质量约2.0×104处检测到目的蛋白带,目的蛋白占酵母表达上清液总蛋白质的35％.微量细胞病变抑制法检测表达产物的生物学活性,检测结果表明,巴斯德毕赤酵母表达的重组ChIFNγ的抗病毒效价为6 400 U/mL.     

基因敲除GCV2的酿酒酵母构建

[目的]构建低甲醇生成的酿酒酵母工程菌用于酿造低甲醇酒。[方法]利用基因敲除技术,敲除酵母代谢甘氨酸生成甲醇途径的甘氨酸裂解酶系的基因GCV2。[结果]成功构建出基因敲除GCV2的工程酵母L5,用L5酿造酒中的相对甲醇含量为131 mg/L,比初始菌株的192 mg/L降低31%。[结论]利用基因敲除GCV2的工程酵母菌可有效减少酒中由甘氨酸代谢生成甲醇的量。     

mleA基因在酿酒酵母中的整合型表达

 【目的】进行中国自行筛选的专利菌种酒酒球菌 SD-2a（Oenococcus oeni SD-2a）的苹果酸－乳酸酶基因在酿酒酵母中的整合型表达,使葡萄酒生产过程中的酒精发酵和苹果酸－乳酸发酵（malolactic fermentation,MLF）同时进行。【方法】克隆Oenococcus oeni SD-2a的苹果酸－乳酸酶基因mleA,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以酵母整合型质粒YIp5为载体,构建重组表达质粒pYILmleA,并转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS59,经筛选鉴定获得酵母转化子YS59/pYILmleA。进行转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定、SDS-PAGE检测及斑点杂交检测,并对酵母转化子培养上清液进行L-苹果酸及L-乳酸含量的HPLC分析,检测目的基因的功能性表达。【结果】转化子的营养缺陷型和交配型鉴定、菌落PCR鉴定表明获得了阳性转化子;SDS-PAGE检测表明获得的转化子表达了目标蛋白,斑点杂交检测表明目的基因整合到受体菌中。模拟发酵表明mleA基因整合到受体菌中后进行了功能性表达,将培养基中的L-苹果酸转化成L-乳酸,使得培养液中的L-苹果酸含量极显著降低。转化子YS59/pYILmleA在添加5 648 mg?L-1 L-苹果酸和10%葡萄糖的SD/-Ura培养基中培养4 d,培养液上清中L-苹果酸的剩余含量与空载体转化子YS59/YIp5（对照）差异极显著,苹果酸的相对降低率为20.18%～20.85%。供试的转化子L-乳酸生成量为1 278～1 312 mg?L-1,对照未检出乳酸的生成。【结论】中国自主筛选的专利菌种O.oeni SD-2a的mleA基因的整合型表达质粒构建成功并在酿酒酵母中进行了功能性表达。     

YDL080 c基因缺失的低异戊醇酿酒酵母菌构建

[目的]构建YDL080c基因缺失的低异戊醇生成的酿酒酵母菌。[方法]利用Cre-lox P重组系统与酵母电转化法敲除酿酒酵母中编码类丙酮酸脱羧酶的基因YDL080c,切断酿酒酵母代谢中的异戊醇生成,从而构建一株低异戊醇生成的酿酒酵母菌株。[结果]成功构建出YDL080c基因缺失的工程酵母菌Y1,Y1酿造酒中相对异戊醇含量为0.81 g/L,比初始菌降低28.3%。[结论]利用基因敲除YDL080c的工程酵母菌能够有效减少酿造酒中异戊醇的生成量。     

Integrated Expression of the Oenococcus oeni mleA Gene in Saccharomyces cerevisiae

Malolactic enzyme is the function enzyme which catalyses the reaction for L-malate converting to L-lactic during malolactic fermentation （MLF）. In this paper, researches concerning the malolactic enzyme gene mleA cloned from a patent strain Oenococcus oeni SD-2a screened in Chinese wine and integrated expressing in Saccharomyces cerevisiae were performed in order to carry out both alcoholic fermentation （AF） and malolactic fermentation （MLF） during winemaking, with a view to achieving a better control of MLF in enology. To construct the expression plasmid named pYILmleA, cloned mleA gene, PGK1 promoter, and ADH1 terminator were ligated and inserted into integrating vector YIp5. Yeast transformants were screened on SD/-Ura and identified by auxotrophic test, mating type test, and colony PCR. Target protein was detected by SDS-PAGE and the targeted gene integrated to the chromosome was detected by dot bloting hybridization. After the transformant was cultured in SD/-Ura adding glucose （10%） and L-malate （5 648 mg L-1） for 4 d, the culture supernatant was collected and L-malate and L-lactic acid contents were detected by HPLC. 1 278-1 312 mg L-1 L-lactic acids were detected, while the comparative drop rates of L-malate were 20.18-20.85%. L-malate and L-lactic contents of the transformants showed extra significant difference and significant difference with the control ones by t-test respectively. The result indicated that the functional expression was achieved in recombinants S. cerevisiae.     

耐高渗蜂蜜酒酵母的选育

根据酵母菌的生理特性,通过改变酵母的生长和繁殖条件,即通过逐渐提高培养液浓度,将中国科学院微生物研究所的As2612,As2614,As2400,As2420 4种酵母分别定向驯化成DP_1,DP_2,DP_3,DP_4 4株耐高渗的适宜酿制蜜酒的酵母。发酵力对比试验和酿制蜂蜜酒比较试验表明:DP酵母的发酵力显著提高,发酵蜜酒的周期缩短了1/2以上。     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因酿酒酵母表达载体的构建

以重组质粒pBAD-LRCP-126为模板,经PCR扩增获得了PLRV缺失突变CP基因的特异性条带。目的片段与pYES2.1/V5-His/-TOPO的连接产物转化大肠杆菌TOP10F′获得了氨苄青霉素抗性菌落,酶切与DNA测序结果确认了酵母表达载体的正确性,该表达载体命名为pYES-LRCP-126。在30℃,酿酒酵母工程菌株INVSc1(pYES-LRCP-126)经2%半乳糖诱导培养16h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条23kDa的诱导表达的蛋白条带,其大小与预期的重组CP大小相符,表明PLRV缺失突变基因在酵母菌中实现了表达。