大麦黄矮病毒缺失复制酶基因植物表达载体的构建及转基因小麦的获得

以大麦黄矮病毒GPV株系的RNA为模板,采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法,扩增出1134bp的缺失复制酶基因。将扩增的片段克隆到pUC19的SmaI位点上并进行了序列测定,获得正向插入的重组质粒pUC19D。以KpnI和XbaI从pUC19D上切下此基因并插入质粒pEmu-mcs-N得到植物表达载体pPPI8。应用花粉管通道法转化普通小麦品种陇鉴127、陕160和晋麦47,通过卡那霉素抗性筛选、PCR和PCR-Southern检测,3个品种均获得了转基因小麦植株。     

转基因小麦抗大麦黄矮病毒研究进展

转基因技术为培育抗黄矮病小麦提供了一条有力的途径,综述国内外在小麦抗BYDV的转基因研究进展。探讨目前主要基于BYDV自身的外壳蛋白基因、复制酶基因、运动蛋白基因以及蚜虫传毒相关蛋白基因进行的抗BYDV小麦转基因研究现状和成果,并对未来培育抗黄矮病小麦研究进行展望。     

大麦黄矮病毒研究进展

<正> 黄矮病是禾谷类.特别是麦类作物的重要病害。许多国家以及一些国际研究机构(如国际玉米、小麦研究中心CIMMYT)相继对该病害开展研究.寻找其防治途径。本文概述了黄矮病毒的研究进展。一、黄矮病的发生及症状禾谷类作物的黄矮病是由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus.简称BYDV)的侵染所引起的,在世界各国均有发生。在50年代初,美国的一些研究者首次发现大麦的黄矮病是由一种病毒的侵染所引起的,井命名     

马铃薯Y病毒复制酶基因植物表达载体构建及转基因烟草的培育

用ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ从重组克隆ＰＺＤ－１中切下马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系复制酶基因，将其插入质粒ＰＲＯＤ２相庆切点中构成植物表达载体。用重组ｐＲＯＤ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，通过重组农杆菌侵染叶盘将复制酶基因转入烟草品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测结果表明，复制酶基因在转基因烟草中获得品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测     

哈尔滨地区大麦黄矮病毒株系鉴定

从黑龙江省哈尔滨地区田间采集典型小麦黄矫病株２５份，用无毒麦二叉蚜，禾谷缢管蚜传毒，经生物学分离并用ＢＹＤＶ－ＧＡＶ，ＰＡＶ，ＲＰＶ，ＳＧＶ四种抗血清静 进行酶联免疫吸附测定。结果表明：２５份标样中由麦长管蚜和麦二叉物有２２份，与ＧＡＶ抗血清有强反应，而与ＰＡＶ，ＲＰＶ，ＳＧＶ抗血清无反应。     

小麦抗大麦黄矮病毒育种研究综述

从科学发展的角度出发,论证了小麦抗黄矮病育种的重要性;阐明了自50年代发现BYDV以来,经过科学家们长期不懈的努力,将抗BYDV基因由小麦近缘种导入普通小麦,逐步育成双二倍体、异附加系、异代换系和易位系材料,最终应用于抗病育种实践;明确了不同抗性基因的遗传差异;指出了抗黄矮病育种的伟大成就;提出了现阶段抗病育种中存在的问题及未来研究的方向。     

中国大麦黄矮病毒及 BYDV-GAV 株系研究进展

大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus, BYDVs）隶属于黄症病毒科（Luteovirdae）黄症病毒属（Luteovirus）,由该病毒引起的小麦黄矮病最早在美国发生并报道,此后在国外其他地域也曾有过发生报道。在我国,小麦黄矮病最早于 1960 年在陕西、甘肃发生并报道,近年来,在我国其他地区也有发生,该病害被称为麦类作物上的“癌症”,对麦类作物生产影响较大,为害严重时,造成麦类作物产量大幅降低。BYDV 株系的划分依据为其传毒介体蚜虫的传播专化性,即一个病毒株系只能由一种或两种蚜虫进行传播,根据 ICTV 国际病毒委员会分类系统报道,目前国际上确定的该病毒株系有 BYDV-MAV、BYDV-PAV、BYDV-RMV、BYDV-SGV 等,我国鉴定有 BYDV-PAV、BYDV-GPV、BYDV-GAV、BYDV-RMV 4 个株系,GAV 为我国流行株系。主要从 BYDV 的为害症状、株系分化、传播介体、基因组结构和功能、病害防治方面进行相关综述,着重介绍 BYDV-GAV 株系的抗性鉴定、抗性基因等方面的相关研究进展,以期为该病害的抗病育种和防治提供一定的理论基础。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白（Coat Protein CP）和移动蛋白（Movement Protein MP）基因序列合成了CP、MP基因的上下游引物。通过PCR扩增获得含有目的基因的片段，经过SalⅠ和PstⅠ双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子、克隆寄主因子、推测其种类和功能奠定了基础。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和移动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat protein,CP)和移动蛋白(Movement protein,MP)基因序列合成了CP和MP基因的上下游引物,通过PCR扩增获得目的片段,经过Sal I和Pst I双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序,构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP,用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白,为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子和克隆寄主因子,以及其种类和功能打下坚实的基础.     

大麦黄矮病毒（BYDV—GPV）的循回传播机理

对植物组织中蚜虫口针分泌的胶状唾液染色观察发现，蚜虫刺探时口针穿行在细胞间隙，仅在吸食时下颚口针进入细胞内。禾谷缢蚜饲毒１２ｈ时的ＲＴ－ＰＣＲ方法在后肠，血淋巴液和附唾液腺中检测到ＧＰＶ；而非介体麦长管蚜在ＧＰＶ毒源上吸食２４ｈ时，仅在后肠组织中检测到ＧＰＶ；当继续取食４８ｈ时，在后肠及血淋巴液中也发现了ＰＧＶ，但仍无能力进入附唾液腺，说明蚜虫后肠对病毒均有专化选择作用，禾谷缢管蚜传播ＢＹＤＶ－Ｇ     

25份青稞品种对大麦黄矮病毒的抗性鉴定与评价

[目的]明确不同青稞品种抗大麦黄矮病毒的差异。[方法]于2018年采用田间人工接种法对25份青稞品种进行由大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus,BYDV)引起的青稞黄矮病的田间抗性鉴定和评价。[结果]在供试25个品种中未监测到免疫(IM)和高抗(HR)材料;仅1份材料康青7号表现抗(R);云枝黑青稞、北青8号、甘青4号、藏青320、昆仑1号、长青裸大麦、黄青2号、藏青148、牡丹青稞、甘青3号、青海黄、北青6号、北青7号、昆仑15号和甘青2号15份材料表现中抗(R);甘青1号、新民元棱、双胚青稞、黄青1号、柴青6号、肚里黄、康青3号和冬青8号8份材料表现感(S);1份品种喜马拉雅6号表现高感(HS),分别占供试材料的4.0%、60.0%、32.0%和4.0%。将25份青稞品种进行聚类分析,结果表明,以最长距离0.65作为最佳分割点,将试验品种分为1个抗病品种、15个中抗品种、8个感病品种和1个高感品种,与抗性类型完全吻合。[结论]获得的这些有效抗病品种,为品种的合理布局及抗病育种提供核心抗源。     

大麦黄矮病毒GPV株系运动蛋白基因原核表达载体的构建

大麦黄矮病毒GPV株系ORF4基因编码一种17 kDa的蛋白,利用一对特异性引物,通过RT-PCR对ORF4基因进行了扩增,序列测定表明其长度为456 bp,与已报道的序列一致,并构建了原核表达载体。     

缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的克隆及植物表达载体构建

以CMV亚组1株系Fny-CMV RNA2基因组为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到2.5 kb的全长复制酶基因扩增产物.对此产物进行纯化,并用NcoI和BspHI进行双酶切,得到3个片段,将不含有GDD保守区的2个片段用T4 DNA连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到2.2kb左右缺失GDD保守区的黄瓜花叶病毒复制酶基因的扩增产物.将其克隆到pGEM-T Easy Vector上,进行序列测定,结果表明GDD保守区确已缺失.该缺失不导致开放阅读框架的移码将缺失GID保守区的基因定向克隆到植物表达载体pBI121中,并经三亲交配导入根癌农杆菌中,经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入.     

大麦黄矮病毒合肥分离物的鉴定及CP基因进化分析

[目的]为了明确合肥地区大麦黄矮病毒株系种类及分子变异情况。[方法]利用生物学手段和RT-PCR方法鉴定了2009年采自合肥地区的19个分离物,并测定了分离物的外壳蛋白基因（CP基因）的序列。[结果]合肥地区的12个分离物被鉴定为BYDV-PAV,CP基因序列比对发现核苷酸一致性为95.8%～99.7%。系统进化树分析得知,12个合肥分离物序列聚类到一个分支上,它们与中国分离物PAV-CN（AY855920）的CP基因亲缘关系最近。[结论]掌握合肥地区大麦黄矮病毒的株系分布及分子变异情况,对指导该地区小麦黄矮病的抗性育种和防治工作有着非常重要的意义。     

天蓝冰草和八倍体小冰麦对大麦黄矮病毒抗性的研究

 本文对天蓝冰草的两个变种——蓝色变种、茸毛变种，6种八倍体小冰麦——中1、中2、中3、中4、中5（中4无芒）和苏联多年生小麦及其亲本进行了抗大麦黄矮病毒（BYDV）的研究。试验中使用了GAV、GPV和PAV等3个BYDV株系。试验分别在温室和田间进行。结果表明，天蓝冰草的两个变种对BYDV免疫；6种八倍体小冰麦对BYDV都有抗性，其中中3、中4、中5和苏联多年生小麦高抗BYDV，中1和中2的抗性低于上述4种。在相同条件下，八倍体小冰麦的亲本小麦对BYDV均无抗性，说明八倍体小冰麦的抗性均来自天蓝冰草。 由于已知八倍体小冰麦中1和中2带有基本相同的天蓝冰草染色体组，而中3、中4和中5带有相同的天蓝冰草染色体组，苏联多年生小麦携带的天蓝冰草染色体组既不同于中2的，也不同于中3的，可能是另一个天蓝冰草染色体组。所以可以推测天蓝冰草对BYDV的抗性是由分布在3个染色体组中的多基因控制的。但3个染色体组所决定的抗性水平不同，其中的两个染色体组，即中3、中4、中5所携带的天蓝冰草染色体组和苏联多年生所携带的天蓝冰草染色体组抗性水平较高。另一个染色体组，即中1和中2所携带的天蓝冰草染色体组抗性水平较低。     

大麦黄矮病毒GAV株系通读蛋白基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

 以大麦黄矮病毒 ( BYDV) GAV株系的 RNA为模板 ,通过 RT- PCR扩增获得通读蛋白 ( readthrough protein　RTP)基因的目的片段。将其重组到 p GEM- 7zf( + )并转化 JM1 0 9得到了含有完整 RTP基因的重组子。采用双脱氧终止法进行序列分析。结果表明 ,RTP基因为1 377nt,与文献〔1〕报道的血清学较密切的 BYDV MAV- PS1相比 ,核苷酸和氨基酸的同源性分别为 87.4%和 87.1 %。将此 RTP基因克隆到原核表达质粒 p ET- 5a上 ,在大肠杆菌 BL2 1( DE3)中用 IPTG诱导表达 ,利用分离包含体的方法结合 SDS- PAGE电泳 ,得到了纯化的分子量为 66ku的非融合蛋白     

大麦黄矮病毒GAV株系通读蛋白基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以大麦黄矮病毒（ＢＹＤＶ）ＧＡＶ为模板,通过ＲＴ－ＰＣＲ护增获得通读蛋白（readthrough protein RTP)基因的目的版段,将其重组到pGEM-7zf( )并转化ＪＭ１０９利到了含有完整ＲＴＰ基因的重组子,采用又脱氧终上法进行序列分析。结果表明,ＲＴＰ基因为１３３７nt,与文献报道的血清学较密切的ＢＹＤＶ ＭＡＶ－ＰＳ１相比,核苷酸和氨其酸的同源性分别为８７．４％和８７．１％。将些ＲＴＰ基因克隆到原核表达质粒pET-5a上,在大肠植菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中用ＩＰＴＧ旅导表达,利用 分离包含体的方法结合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳,利到了纯化的分子是为６６ku的非融合蛋白。     

番茄黄化曲叶病毒Rep基因植物表达载体的构建及对番茄的遗传转化

克隆番茄黄化曲叶病毒的复制酶基因(TYLCV-Rep),并构建其植物表达载体,通过农杆菌介导法转入番茄子叶外植体。经过共培养、潮霉素筛选和分化再生,获得21株潮霉素抗性植株。PCR检测和Southern Blot检测结果表明,有3株呈阳性检测反应,说明TYLCV-Rep基因已整合到番茄基因组中,阳性率为14.3%。烟粉虱接种试验结果表明,番茄转基因植株较非转基因植株对番茄黄化曲叶病毒的抗性明显增强。