口蹄疫病毒全长cDNA感染性克隆的研究进展

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是一种给畜牧业带来严重经济损失的传染病,FMDV是小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员.其RNA本身的结构特点和不稳定性增加了对其分子结构及功能研究的难度.     

口蹄疫病毒全长cDNA克隆的快速构建

利用RT—PCR和3’cDNA末端快速扩增(RACE)技术分别扩增出包含口蹄疫病毒(FMDV)全基因组的2个重叠cDNA片段，将其分别插入到载体pcDNA3．1zeo( )和pGEM—T—Easy中，然后利用片段本身单一酶切位点将FMDV全长cDNA克隆至pcDNA3．1zeo( )载体，经PCR扩增、酶切鉴定和序列测定。结果表明，重组质粒(pcDNA3．1／FMDV)携带了FMDVOH／99基因组全长cDNA序列。     

猪源口蹄疫病毒China99/S株基因组全长cDNA的构建及其感染性鉴定

提取猪源FMDV China99/S组织样品总RNA,利用设计的引物对,分段进行扩增,获得覆盖全基因组的4个重叠片段(A、B、C和E),然后用BsmB Ⅰ/Xma Ⅰ、Xma Ⅰ/BamH Ⅰ、BamH Ⅰ/Not Ⅰ、Hpa Ⅰ/Kpn Ⅰ分别双酶切A、B、E、C,并纯化回收,依次定向克隆到带有聚合酶Ⅰ的pPⅠ cDNA3.1(+)转录载体内,最终得到重组质粒pP1-FMDVcDNA3.1(+);然后对该质粒进行序列测定.结果表明,China99/S株基因组全基因组序列长8 116 nt(含Poly(C)和Poly(A)片段),其中5′NCR长1 064 nt,蛋白编码区核苷酸序列为6 318 nt,编码1个由2 106个氨基酸组成的聚合蛋白,3′NCR长93 nt,其后是含有38个A碱基的Poly(A)尾.其中5′NCR引入含41个C的Poly(C)片段.将pPⅠ FMDVcDNA3.1(+)用脂质体转染法导入BHK-21细胞,传代培养,可以观察到典型的FMDV致细胞病变效应.利用CPE、电镜、动物试验、RT-PCR和序列测定进行检测,结果表明,从该系统中成功拯救出具有感染性的猪源FMDV China99/S株重组病毒.     

狂犬病病毒口服疫苗株SRV9基因组全长cDNA的克隆及特性分析

为了解狂犬病病毒口服疫苗株SRV9的基因序列与生物学特性的关系，明确其作为疫苗株的分子基础，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，获得了贯穿全基因组的3个重叠的cDNA片段。将获得的cDNA片段分别克隆至pMD-18T载体上并进行序列测定，对测序结果进行拼接得到全长cDNA序列(GenBank登录号：AF499686)。SRV9株与亲本株SAD B19全序列比较分析显示，二者同源性为99．8％，SRV9的变异主要发生在糖蛋白的编码区域，共有5个碱基发生改变．在转录酶蛋白编码区出现2个碱基的改变，其他蛋白编码基因均未出现突变；氨基酸比较分析显示，在转录酶蛋白氨基酸序列发生2个改变；糖蛋白成熟肽的第34位、292位、333位和338位氨基酸分别发生了Gly→Glu。Ala→Thr，Arg→Ser，Ile→Val的改变，其中第34位氨基酸位于第1抗原区，第333位和338位氨基酸位于第1抗原区。这些抗原位点的突变可能是引起病毒蚀斑特性改变、毒力降低和免疫原性及安全性提高的重要原因。     

猪瘟病毒石门株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

参照已发表的猪瘟病毒基因组序列设计合成了9对引物，通过RT-PCR从感染猪瘟病毒的猪全血中扩增得到了覆盖猪瘟病毒石门株基因组全长的9个cDNA片段，将所得片段分别克隆至pOK12载体和pMD18-T载体，经测序和拼接后，获得了猪瘟病毒石门株基因组全序列。序列分析表明，猪瘟病毒石门株基因组全长12297个碱基，含有一个大的开放阅读框架，编码1个由3898个氨基酸残基组成的聚合蛋白，其5’非编码区（5＇UTR）和3’非编码区3’（UTR）分别由373和227个碱基组成，与已发表的2个猪瘟病毒石门株的全序列相比，核苷酸同源性分别为99．4％和99，6％，氨基酸同源性分别为99．4％和99．7％，在3’末端第12133位T碱基发生缺失。比较了27个猪瘟病毒全序列的3’UTR，结果提示12133位碱基T缺失区域可能是猪瘟病毒的高变异区。     

O型泛亚谱系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立

本研究采用RT-PCR技术将O型口蹄疫病毒(FMDV)O/YS/CHA/05株全长基因组分4个cDNA片段进行克隆、拼接,构建了具有感染性的FMDV cDNA克隆pOKT7-OY/S/CHA/05.将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05在细胞外转录获得的病毒RNA转染BHK-21细胞,经培养可见典型的细胞病变(CPE).同时,将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,同样也观察到典型的CPE.对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记,即在病毒核酸的3 510位人工消除了Xba Ⅰ酶切位点.免疫电镜观察和间接免疫荧光试验进一步表明,拯救出了FMDV.病毒生长比较试验表明,拯救病毒与亲本病毒具有相似的增殖特性.本研究构建了O型口蹄疫病毒的感染性克隆并获得了拯救病毒,为深入研究FMDV的致病机理以及开发新型疫苗提供了有效的反向遗传操作平台.     

口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株基因组全长感染性克隆的构建

利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3'端覆盖口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBlueseriptSK+载体上.利用融合PCR扩增到基因组5'端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp),并将其连接至pGEM-T载体.最后将这4个片段的阳性克隆装配至剔除T7启动子的低拷贝载体pcDNA3.1/Zeo(+)中构建该病毒株的全长cDNA克隆.以构建的FMDV Asial/JS/China/2005株全长cDNA为模板,使用TTRNA聚合酶在体外转录得到病毒RNA,通过脂质体将其导入BHK细胞获得拯救病毒.对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析结果证实,通过体外转录获得了具有感染性的口蹄疫病毒.该株感染性克隆的构建为深入研究口蹄疫病毒的致病机制及研制新型疫苗等奠定了基础.     

一株Asia 1型口蹄疫病毒的全基因组序列测定及比较分析

参考GenBank上已发表的口蹄疫病毒（FMDV）全长基因组序列,设计了覆盖基因组全长的数对引物,通过RT-PCR方法对1株Asia1型（简称As01）FMDV进行分段克隆及序列测定,将测序结果利用软件进行拼接。结果表明,该毒株的FMDV基因组[不合poly（C）]全长8180nt,其中编码区为6987nt,5’和3’非编码区（UTR）分别为1078nt和95nt,3＇UTR之后为20nt的poly（A）尾巴。将As01株与其他FMDV参考毒株利用分子生物学软件进行多序列比对分析表明,As01株与Asia 1／Jiangsu／China／2005、Asia 1／Isr 1／3／63、ZB／CHA／58等Asia 1型FMDV遗传进化关系较为密切,而与O型和A型FMDV遗传关系较远。     

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株感染性分子克隆的构建

本研究以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株(野毒株)基因组为模板,用蛋白酶K法提取病毒基因组核酸dsRNA,在cDNA克隆的5'端上游引入了T7启动子序列,采用Long-accurateRT-PCR(LA-PCR)一步法扩增并克隆了病毒基因组A节段与B节段全长cDNA。序列测定结果表明,基因组A节段全长共3267个核苷酸,包括5'及3'端的非编码区和两个部分重叠的开放阅读框,基因组B节段全长共2843个核苷酸,包括5'及3'端的非编码区和一个开放阅读框。将IBDV-Gx株的A节段全长基因组及B节段全长基因组分别克隆入pMD18-T载体,构建成pMD-A、pMD-B两个带有T7启动子的重组质粒。两个重组质粒线性化后,进行体外转录,然后共电转染于鸡胚成纤维细胞37℃培养72h并传代。收获的细胞传代培养物分别用RT-PCR、间接免疫荧光、蚀斑试验等方法进行鉴定,结果用RT-PCR扩增出了VP3及VP5基因片段,间接免疫荧光检测到了特异性的荧光抗体,蚀斑试验结果表明蚀斑形成单位为3×103PFU/mL。     

表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。     

抗Asia1型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

用纯化的Asia1型口蹄疫病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA和间接免疫荧光(IFA)筛选,有限稀释法克隆,获得了2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H6、5G3,其细胞培养上清效价分别为1:64和1:128,小鼠腹水效价分别为1×10~(-4)和8×10~(-3);ELISA和IFA结果显示,2株单抗仅与Asial型口蹄疫病毒反应,不与O型口蹄疫病毒反应,表明它们均为抗Asial型口蹄疫病毒的型特异性单克隆抗体。westem blot结果显示,2株单克隆抗体均不与全病毒抗原反应,表明它们所针对的抗原表位均为构象表位。相加ELISA试验表明,两株单抗识别不同的抗原表位。经硫氰酸盐洗脱法测定,3H6和5G3的相对亲和力指数分别为1.0 mol/L和1.5 mol/L。这2株单抗的获得为建立口蹄疫病毒检测方法提供了强有力的工具。     

1型鸭肝炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建

参考1型鸭肝炎病毒基因组序列,设计7条引物,用RT—PCR方法扩增出覆盖整个病毒基因组三个忠实性片段,并按顺序组装进载体pBR322中,获得全长cDNA克隆。测序结果表明,该克隆与母本毒序列同源性达99．6％,并且5’端的T7启动子和3’端的Mlu I线性化位点均成功引入。     

O型口蹄疫病毒OA58株3C基因的克隆与真核表达

利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640bp的口蹄疫缡毒目的基因，回收片段后与pMD18-T载体进行连接，测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BarnH I＋XhoI双酶切后，进行定向亚克隆，对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序，结果表明重组表达质粒所含的3C基时读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞，荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光；对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定，证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。     

口蹄疫病毒整联蛋白受体的研究进展

从组织分布、各毒株利用率、配体结合区介导感染的能力及β亚基胞质区作用等方面论述了4种整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8的研究进展，旨在阐明各整联蛋白决定口蹄疫病毒宿主组织嗜性的作用，并为口蹄疫病毒致病机制的研究提供理论依据。     

亚洲1型口蹄疫病毒L蛋白缺失株的构建及其生物学定性

为确定口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白缺失对其生物学特性的影响,本研究在已建立的Asia1型FMDV反向遗传操作平台基础上,利用融合PCR方法缺失L蛋白基因编码区,构建了缺失L蛋白的重组Asia1型FMDV(rFMDV-ΔL)。拯救病毒的一步生长曲线结果表明,rFMDV-ΔL与亲本病毒相比在BHK-21细胞中的复制水平下降10倍,乳鼠毒力试验表明rFMDV-ΔL的毒力比亲本毒株下降6倍。另外,rFMDV-ΔL在BHK-21细胞上产生病变的速度明显变慢,形成蚀斑的时间延长,致乳鼠死亡所需时间也比亲本毒株明显延长。本研究是关于亚洲1型FMDVL蛋白结构与功能研究的首次报道,为亚洲1型FMDVL蛋白结构与功能的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒感染与复制多元调控因素研究进展

口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是发生于偶蹄动物的一种急性高度传染性疫病,曾多次在世界范围内暴发流行。FMD致病原口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)于感染后利用多种策略操纵宿主免疫机制和逃避抗病毒反应,以利于其感染复制。现对最近几年来影响调控FMDV感染与复制的多种因素从不同角度进行总结分析,以期为后续研究提供参考。     

Genome analysis and development of infectious cDNA clone of a virulence-attenuated strain of foot-and-mouth disease virus type Asia 1 from China

The RNA genome sequence of the rabbit passage-attenuated strain of foot-and-mouth disease virus (FMDV) Asia 1, ZB/CHA/58(att), was determined to be 8165 nt in length excluding the poly(C) tract in the 5′ UTR and the poly(A) tail at the 3′ end. ZB/CHA/58(att) was most similar to the vaccine strain Asia 1/YNBS/58 in genome sequence and there were no deletions or insertions within the deduced polyprotein between ZB/CHA/58(att) and YNBS/58, but there were a total of 25 substitutions at the amino acid level and an extra 19-nt stretch in the 5′ UTR was found in ZB/CHA/58(att). An infectious full-length cDNA clone of ZB/CHA/58(att) was developed. Infectious virus could be recovered in BHK-21 cells transfected with the synthetic viral RNA transcribed in vitro. The plaque morphology, growth kinetics and antigenic profile of the infectious clone-derived virus (termed tZB) were indistinguishable from those induced by the parental virus. Furthermore, the virulence properties of ZB/CHA/58(att) and tZB were found to be highly similar in the mouse model. The availability of genome sequence information and infectious cDNA clone of the FMDV ZB/CHA/58(att) lays a new ground for further investigation of FMDV virulence determinants and development of new potent vaccine to FMD.