广西巴马小型猪肥胖基因（leptin）成熟肽序列的cDNA克隆、序列分析

以广西巴马小型猪的脂肪组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增出巴马小型猪的leptin基因成熟肽序列,经纯化回收后连接到pMD18-T载体上,经鉴定后测序。研究结果表明,本试验克隆到leptin基因成熟肽cDNA序列,其长度为441bp,与GenBank中报道的猪leptin成熟肽cDNA序列同源性高达99．06％,与奶牛、家鼠、马等物种的成熟肽cDNA序列间同源性可达到84．5％以上,证明leptin基因具有较高的保守性。同时发现,与普通猪相比,巴马小型猪leptin基因成熟肽cDNA序列有四处存在碱基突变,均为元义突变。     

水牛Follistatin cDNA克隆及序列分析

卵泡抑索（Follistatin,FS）可通过旁分泌和自分泌的方式抑制促卵泡素（FSH）的分泌,从而影响动物的繁殖机能。本研究拟通过分析水牛的FS cDNA序列来分析其繁殖性能低的可能原因。试验参照GenBank公布的奶牛的FS cDNA序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增目的基因,再将其亚克隆到pMD-18T克隆载体进行测序。测序结果显示本试验成功获得了水牛的FS cDNA序列。同源性及进化树分析提示FS在哺乳动物进化上高度保守。研究发现两处氨基酸的突变,这可能影响FS正常的生物学功能发挥,从而影响水牛的繁殖机能。     

加州鲈卵泡抑素cDNA的克隆、分析和原核表达

卵泡抑素是TGF-β超家族中一些成员的抑制蛋白，具有促肌肉生长的作用。采用RT-PCR和RACE技术从加州鲈成鱼卵巢总RNA中扩增得到卵泡抑素cDNA，序列分析结果表明，加州鲈卵泡抑素cDNA全长1444bp，包括开放阅读框966bp，5¢非编码区82bp，3¢非编码区359bp。该基因编码321个氨基酸，其中信号肽31个氨基酸，成熟肽290个氨基酸，成熟蛋白由四个功能区组成，分别为：N-domain、Domain Ⅰ、Domain Ⅱ和Domain Ⅲ，其中N-domain具有与TGF-β超家族中一些成员特异性结合的结构，可抑制这些蛋白发挥作用。将加州鲈卵泡抑素氨基酸序列与红鳍东方鲀、草鱼、斑马鱼、大西洋鲑和斑点叉尾鮰比较，同源性分别为97％、89％、88％、88％和70％，其中N-domain氨基酸序列的保守性更高一些，与红鳍东方鲀、草鱼、斑马鱼、大西洋鲑、斑点叉尾鮰、非洲爪蟾、人、猪、大鼠、鸡的相比较，同源性为75%～100％。为获得重组卵泡抑素蛋白，将成熟肽cDNA插入表达载体pET-32a(+)，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测，结果检测到一分子量约52kD的特异蛋白带，与预期大小一致，Western blot检测到表达产物表明成功获得了卵泡抑素的融合蛋白。加州鲈卵泡抑素cDNA序列和重组蛋白的获得为进一步研究鱼类卵泡抑素的促肌肉生长奠定了基础。     

脂质体法构建广西巴马小型猪转基因体细胞及转基因克隆胚的生产

脂质体法是一种传统的向哺乳动物细胞导入外源基因的方法,然而其转染效率受多种因素影响。本研究将从脂质体和质粒DNA量、转染暴露时间以及混合孵育时间等四方面进行探索,以寻找最佳的转染体系。试验结果表明最佳转染体系为：脂质体1.25μL、DNA 0.7μg、脂质体-DNA混合孵育0 min以及转染暴露6 h。随后我们用优化过的转染体系对新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞进行转绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）操作,获得了（26.45±2.11）%的转染率,并以此为核供体经体细胞核移植技术成功构建表达GFP的广西巴马小型猪克隆胚胎,同时证实转基因克隆胚的体外发育能力比得上非转基因克隆胚。这为我们构建用于人类疾病研究的基因修饰广西巴马小型猪奠定了基础。     

电转染法电压优化与广西巴马小型猪转基因克隆胚胎的生产

本试验旨在优化电转染电压并构建转基因体细胞,为生产转基因广西巴马小型猪打下技术储备。以新生广西巴马小型猪肾脏成纤维细胞和pEGFP-N1为材料、以细胞存活率和转染率为电转染效率评价指标,筛选最佳电压,然后用优化电压进行电转染并经G418抗性筛选获得转基因体细胞系,通过体细胞核移植技术获得转基因克隆胚胎。本研究筛选出最佳电压为120 V,用优化电压进行电转染并成功构建表达GFP的转基因细胞,最后通过体细胞核移植成功获得表达GFP的转基因克隆胚胎。结果表明优化的电转染电压可以高效构建广西巴马小型猪转基因体细胞,并可通过体细胞核移植生产转基因克隆胚胎。     

山羊促卵泡激素α和β亚单位cDNA的克隆与序列分析

促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)是由动物脑垂体前叶分泌的一种糖蛋白类促性腺激素,由α和β两个糖基化亚单位以非共价键连接而成[1,2].使用常规设备和生化方法很难将其分离纯化,在现有的FSH制品中多混杂有上述结构相似的激素,使得FSH作用机理和应用研究受到限制.     

斑马鱼干扰素(zIFN)cDNA分子克隆与序列分析

Stephen(2003)等首次报道了低等脊椎动物一斑马鱼干扰素基因(zIFN)，揭示了zIFN氨基酸序列与脊椎动物干扰素的同源性为14％～23％。为了证实zIFN基因的存在以及进一步利用干扰素基因，本实验参照zIFN基因序列设计了引物对，采用RT-PCR法克隆了AB品系斑马鱼干扰素基因，并发现zIFN存在变异、可分为亚型。     

猪CD8α全长cDNA克隆与序列分析

应用RT-PCR和RACE技术从猪胸腺细胞总RNA中扩增克隆了猪CD8α的全长cDNA基因。序列分析结果表明，CD8α全长cDNA序列为2179nt（GenBank收录号AY517855）。711nt的开放阅读框编码236个氨基酸残基的猪CD8α前体蛋白（含1个N-糖基化位点）推导氨基酸序列分析显示，存猪CD8α分子的胞外区，7个保守性Cys残基（Cys^46、Cys^57、Cys^118、Cys^167、Cys^216、Cys^218和Cys^182）与猪CD8α分了胞外区免疫球蛋白样结构以及αβ异源二聚体或αα同源二聚体的形成有关。在猪CD8α分子胞浆区，存存与CTL活化信号转导相关的Src家族蛋白酪氨酸激酶p56^kk识别基序CKCP。氨基酸序列比较结果表明，猪与人、牛、鼠、狗和猫CD8α蛋h的氯基酸同源性分别为55．7％、57．6％、35．6％、56．8％和56．4％。     

表达人CD47基因的巴马小型猪创建及其表达分析

异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径之一,猪(Sus scrofa)是人类(Homo sapiens)异种器官移植的理想供体.然而,异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白α(singal regulatory proteinα,SIRPα)不能特异地识别异种细胞表面的整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP又称CD47),导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除.本研究在敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的巴马小型猪基础上,转入hCD47基因,制备表达hCD47基因的GTKO/hCD47巴马小型猪,可避免超急性排斥反应并减弱受体巨噬细胞对移植物细胞的吞噬.首先构建巨细胞病毒增强子和鸡β肌动蛋白启动子(cytomegalovirus early enhancer/chicken β-actin promoter,CAG)调控的hCD47基因表达载体pCAGGS-hCD47-Neo,转染GTKO巴马小型猪的耳成纤维细胞,然后通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪.利用PCR对克隆仔猪进行转基因鉴定,通过qRT-PCR、Westem blot和免疫组化等方法分析hCD47在转基因猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织的表达.抽取存活仔猪血液进行生理指标检测,监测其健康状况.通过体细胞克隆技术获得了13头转基因克隆猪,PCR鉴定均为hCD47基因阳性猪.qRT-PCR结果显示,hCD47基因在各器官中的表达量由高至低依次为胰腺、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和心脏.Western blot及免疫组化结果进一步证实hCD47基因在胰腺、肝脏等中均具有较强表达,与qRT-PCR结果一致.血液生理指标显示,存活仔猪健康状况良好.本研究成功制备了表达hCD47基因的GTKO巴马小型猪,确证了hCD47基因在主要器官中的表达特征,将有助于探究hCD47基因在减弱受体巨噬细胞对异种移植各器官的排斥反应.     

猪5-HT4b受体基因cDNA克隆和序列分析

利用RT—PCR技术克隆了猪5-HT4bR基因的核苷酸序列，并利用生物信息学手段进行了验证。核苷酸序列测定与分析表明，该基因片段全长1209bp且包含一个完整的开放阅读框，编码402个氨基酸。该序列已在GenBank登录（Accession No．AY566638）。序列分析结果表明，该基因与已报道的人、鼠等5种动物5-HT4bR基因具有较高的核酸序列和氨基酸序列同源性，分别为92．56％和93．63％。该基因编码的蛋白具有7次跨膜结构，属于G蛋白偶联受体超家族。     

狂犬病病毒3aG株核蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

从狂犬病病毒感染的ＢＨＫ细胞裂解上清液中快速提取病毒ＲＮＡ,用反转录－聚合式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法得到编码核蛋白完整结构基因的ｃＤＮＡ,进一步将此基因克隆入ｐＵＣ１８中,进行核苷酸序列分析,并与国外ＰＶ、ＣＶＳ、ＳＡＤＢ１９株以及国内５ａＧ株的Ｎ基因序列进行了同源性比较,证明所克隆Ｎ基因正确。     

猪Fas基因的克隆及序列分析

从PK-15细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出猪F as基因,将其克隆到PM D 18-T载体上,进行序列分析。结果表明,克隆的猪F as基因序列与G enB ank上登录的猪F as基因同源性为100%,与人、牛、羊的F as基因核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为73.4%、79.2%、76.4%和56.2%、67.0%、64.6%。F as蛋白胞内区的死亡域,其氨基酸序列在猪、人、牛和羊的F as基因中呈现较高的同源性。     

金柑LEAFY同源基因克隆与全序列分析

通过PCR扩增,从融安金柑基因组DNA中克隆出一条2 361 bp的DNA片段,该DNA克隆含有1个2 081 bp的LEAFY同源基因全长序列(FcLFY)。金柑LEAFY同源基因包含2个内含子和3个外显子,编码398个氨基酸。比对结果表明,金柑LEAFY同源基因与甜橙、枳的LEAFY同源基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为98%。该研究为今后从分子水平上研究金柑开花调控机理打下了坚实的基础。     

氯粘康酸环异构酶基因克隆及序列研究

研究从土壤中分离出1株降解2,4-二氯酚能力较强的假单胞菌菌株“GT241-1”,并从中克隆出参与降解2,4-二氯酚的氯粘康酸环异构酶基因(dcpC),该基因编码的氯粘康酸环异构酶可将2,4-二氯-顺,顺-粘康酸转化为反式-2-氯-双烯内酯。采用的基因克隆策略是用Southern杂交对其邻近基因进行定位后构建基因组文库,再用斑点杂交从基因文库中筛选目的转化子。经序列测定得知dcpC基因编码区1110bp,且核苷酸和推测的编码氨基酸序列分析表明dcpC属氯粘康酸环异构酶基因家族,并与该基因家族的其他基因有一定差异。     

齿肋赤藓乙醛脱氢酶基因ALDH21的克隆与表达分析

本文采用RT-PCR方法,从齿肋赤藓（Syntrichia caninervis）总RNA中获得ALDH21基因cDNA序列,连接到pMD19-T载体上并转化E.coli DH5α,阳性克隆经PCR鉴定后测序,将测序结果与GenBank中山墙藓（Tortula ruralis）和小立碗藓（Physcomitrella patens）相关基因序列进行同源性比对。结果表明,实验成功克隆了S.caninervis的ALDH21基因的cDNA序列（GenBank登录号：GQ245973）,为一个完整的ORF,其长度为1452bp。该序列与T.ruralis和P.patens的cDNA序列同源性分别为98%和78%,推导的氨基酸同源性分别为97%和87%。生物信息学分析表明该蛋白质分子量为52.98kD,等电点pI为5.96,编码483个氨基酸,具备ALDH21蛋白家族特征;半定量RT-PCR结果表明：ALDH21在干旱胁迫状态时的表达量显著高于水合状态,说明ALDH21基因可能参与干旱胁迫应答。本文为进一步研究齿肋赤藓ALDH21基因的抗旱机理提供理论依据。     

中国人白细胞介素-12 (hIL-12)cDNA克隆及序列分析

根据已发表的IL-12两个亚基P35 cDNA序列（NM-000882）与P40 cDNA序列（NM-002187）设计2对引物。以LPS刺激的人脐血淋巴细胞为材料，采用RT-PCR技术从总RNA扩增hIL-12基因，包括完整的前体蛋白编码序列。所得到的序列与GenBank中发表的一致，但与CLMF和NKSF序列有所差异。P35同CLMF相比，244aa密码子GAC（Asp）→GAT（Asp）、247aa密码子ACG（Thr）→ATG（Met）；与NKSF比较，44aa密码子GTC（Val）→GTG（Val）。P40同NKSF比较239aa密码子AAC（Asn）→AAG（Lys），291aa密码子ACC（Thr）→ACG（Thr）；P40同CLMF相比较，氨基酸与核苷酸序列完全一致。通过与不同物种氨基酸及核苷酸序列比较分析，P40亚基与其它动物的同源性80％以上，P35亚基与其它动物同源性在70％。